ผลการต่อต้านไบโอฟิล์มและการกระตุ้นการรักษาของน้ำสลัดไนเตรตสีเงิน

ขอบคุณสำหรับการเยี่ยมชม Nature.com รุ่นของเบราว์เซอร์ที่คุณใช้มีการสนับสนุน CSS จำกัด เพื่อผลลัพธ์ที่ดีที่สุดเราขอแนะนำให้คุณใช้เบราว์เซอร์รุ่นใหม่กว่า (หรือปิดการใช้งานโหมดความเข้ากันได้ใน Internet Explorer) ในระหว่างนี้เพื่อให้แน่ใจว่าการสนับสนุนอย่างต่อเนื่องเรากำลังแสดงเว็บไซต์โดยไม่ต้องจัดแต่งทรงผมหรือ JavaScript
การเจริญเติบโตของจุลินทรีย์ในบาดแผลมักจะแสดงให้เห็นว่าตัวเองเป็นแผ่นชีวะซึ่งรบกวนการรักษาและยากที่จะกำจัด น้ำสลัดสีเงินใหม่อ้างว่าต่อสู้กับการติดเชื้อที่แผล แต่ประสิทธิภาพของแอนติบิโอฟิล์มและผลการรักษาที่ไม่ขึ้นกับการติดเชื้อนั้นไม่เป็นที่รู้จัก การใช้แบบจำลองในหลอดทดลองและในวิฟฟิล์มชีวภาพของ Staphylococcus aureus และ Pseudomonas aeruginosa เรารายงานประสิทธิภาพของเครื่องแต่งกาย Ag1+ ที่สร้างไอออน Ag1+ เครื่องแต่งกายที่มีกรด ethylenediaminetetraacetic และ benzethonium chloride (AG1+/EDTA/BC) และน้ำสลัดที่มีซิลเวอร์ไนเตรต (Ag oxysalts) ซึ่งผลิต Ag1+, Ag2+ และ Ag3+ ไอออนเพื่อต่อสู้กับแผ่นฟิล์มชีวภาพและผลกระทบต่อการรักษา AG1+ เครื่องแต่งกายมีผลกระทบน้อยที่สุดต่อแผ่นฟิล์มชีวภาพในหลอดทดลองและในหนู (C57BL/6J) ในทางตรงกันข้ามเกลือ AG ออกซิเจนและการแต่งตัว AG1+/EDTA/BC ลดจำนวนแบคทีเรียที่ทำงานได้อย่างมีนัยสำคัญในแผ่นชีวะในหลอดทดลองและแสดงให้เห็นถึงการลดลงอย่างมีนัยสำคัญในส่วนประกอบของแบคทีเรียและ EPS ในแผ่นชีวะของเมาส์ การแต่งกายเหล่านี้มีผลกระทบที่แตกต่างกันในการรักษาบาดแผลที่ติดเชื้อฟิล์มชีวภาพและไม่ติดเชื้อชีวภาพด้วยการแต่งกายด้วยเกลือออกซิเจนมีผลประโยชน์มากขึ้นต่อการเกิดซ้ำขนาดแผลและการอักเสบเมื่อเทียบกับการรักษาด้วยการควบคุมและเครื่องแต่งกายเงินอื่น ๆ คุณสมบัติทางเคมีฟิสิกส์ที่แตกต่างกันของน้ำสลัดสีเงินอาจมีผลกระทบที่แตกต่างกันต่อแผ่นชีวะและการรักษาแผลและสิ่งนี้ควรได้รับการพิจารณาเมื่อเลือกการแต่งกายสำหรับการรักษาบาดแผลที่ติดเชื้อฟิล์มชีวภาพ
บาดแผลเรื้อรังถูกกำหนดให้เป็น“ บาดแผลที่ล้มเหลวในการดำเนินการผ่านขั้นตอนปกติของการรักษาในลักษณะที่เป็นระเบียบและทันเวลา” 1 บาดแผลเรื้อรังสร้างภาระทางจิตวิทยาสังคมและเศรษฐกิจสำหรับผู้ป่วยและระบบการดูแลสุขภาพ การใช้จ่าย NHS ประจำปีในการรักษาบาดแผลและ comorbidities ที่เกี่ยวข้องอยู่ที่ประมาณ 8.3 พันล้านปอนด์ในปี 2560-2535 บาดแผลเรื้อรังก็เป็นปัญหาเร่งด่วนในสหรัฐอเมริกาโดย Medicare ประเมินค่าใช้จ่ายประจำปีของการรักษาผู้ป่วยที่มีบาดแผลที่ $ 28.1 - 96.8 พันล้านเหรียญ
การติดเชื้อเป็นปัจจัยสำคัญที่ป้องกันการรักษาแผล การติดเชื้อมักจะปรากฏเป็นแผ่นชีวะซึ่งมีอยู่ใน 78% ของบาดแผลเรื้อรังที่ไม่ได้รับการรักษา แผ่นชีวะจะเกิดขึ้นเมื่อจุลินทรีย์ติดอยู่กับพื้นผิวอย่างถาวรเช่นพื้นผิวแผลและสามารถรวมกันเพื่อสร้างพอลิเมอร์นอกเซลล์ (EPS)-ชุมชนที่ผลิต Biofilm แผลมีความสัมพันธ์กับการตอบสนองการอักเสบที่เพิ่มขึ้นซึ่งนำไปสู่ความเสียหายของเนื้อเยื่อซึ่งสามารถชะลอหรือป้องกันการรักษา 4 การเพิ่มขึ้นของความเสียหายของเนื้อเยื่ออาจเกิดจากกิจกรรมที่เพิ่มขึ้นของเมทริกซ์เมทัลโลโปรตีน, คอลลาเจนเนส, อีลาสเตสและสปีชีส์ออกซิเจนปฏิกิริยา 5 ยิ่งไปกว่านั้นเซลล์ที่อักเสบและแผ่นชีวะเป็นผู้บริโภคออกซิเจนสูงและสามารถทำให้เกิดภาวะขาดออกซิเจนในเนื้อเยื่อในท้องถิ่นเซลล์ที่ลดลงของออกซิเจนที่จำเป็นสำหรับการซ่อมแซมเนื้อเยื่อที่มีประสิทธิภาพ 6
แผ่นชีวะที่เป็นผู้ใหญ่มีความต้านทานสูงต่อสารต้านจุลชีพซึ่งต้องการกลยุทธ์เชิงรุกในการควบคุมการติดเชื้อฟิล์มชีวภาพเช่นการรักษาเชิงกลตามด้วยการรักษาด้วยยาต้านจุลชีพที่มีประสิทธิภาพ เนื่องจากแผ่นชีวะสามารถงอกใหม่ได้อย่างรวดเร็วยาต้านจุลชีพที่มีประสิทธิภาพสามารถลดความเสี่ยงของการก่อตัวขึ้นใหม่หลังจากการผ่าตัด debridement7
เงินถูกนำมาใช้มากขึ้นในการแต่งกายด้วยยาต้านจุลชีพและมักจะใช้เป็นการรักษาบรรทัดแรกสำหรับบาดแผลที่ติดเชื้อเรื้อรัง มีน้ำสลัดสีเงินที่มีวางจำหน่ายทั่วไปแต่ละรายการมีองค์ประกอบเงินที่แตกต่างกันความเข้มข้นและเมทริกซ์พื้นฐาน ความก้าวหน้าในปลอกแขนสีเงินได้นำไปสู่การพัฒนาปลอกแขนสีเงินใหม่ รูปแบบโลหะของเงิน (AG0) เป็นข้อมูลเฉื่อย เพื่อให้ได้ประสิทธิภาพของยาต้านจุลชีพต้องสูญเสียอิเล็กตรอนเพื่อสร้างไอออนิกซิลเวอร์ (AG1+) น้ำสลัดสีเงินแบบดั้งเดิมมีสารประกอบเงินหรือเงินโลหะซึ่งเมื่อสัมผัสกับของเหลวจะสลายตัวเพื่อสร้าง Ag1+ ไอออน AG1+ ไอออนเหล่านี้ทำปฏิกิริยากับเซลล์แบคทีเรียกำจัดอิเล็กตรอนออกจากส่วนประกอบโครงสร้างหรือกระบวนการสำคัญที่จำเป็นต่อการอยู่รอด เทคโนโลยีที่ได้รับการจดสิทธิบัตรได้นำไปสู่การพัฒนาสารประกอบเงินใหม่ Ag oxysalts (Silver Nitrate, AG7NO11) ซึ่งรวมอยู่ในการแต่งกายแผล ซึ่งแตกต่างจากเงินแบบดั้งเดิมการสลายตัวของเกลือที่มีออกซิเจนทำให้เกิดสถานะของเงินที่มีความจุสูงกว่า (Ag1+, Ag2+และ Ag3+) การศึกษาในหลอดทดลองแสดงให้เห็นว่าเกลือเงินออกซิเจนต่ำมีประสิทธิภาพมากกว่าเงินไอออนเดี่ยว (AG1+) ต่อแบคทีเรียที่ทำให้เกิดโรคเช่น Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus และ Escherichia coli8,9 อีกประเภทหนึ่งของการแต่งกายเงินใหม่รวมถึงส่วนผสมเพิ่มเติม ได้แก่ กรด ethylenediaminetetraacetic (EDTA) และ benzethonium chloride (BC) ซึ่งมีการรายงานไปยังเป้าหมาย Biofilm EPS และเพิ่มการเจาะเงินลงในแผ่นชีวะ เทคโนโลยีเงินใหม่เหล่านี้นำเสนอวิธีการใหม่ในการกำหนดเป้าหมายแผ่นชีวะบาดแผล อย่างไรก็ตามผลกระทบของยาต้านจุลชีพเหล่านี้ต่อสภาพแวดล้อมของแผลและการรักษาที่ไม่ขึ้นกับการติดเชื้อเป็นสิ่งสำคัญเพื่อให้แน่ใจว่าพวกเขาไม่ได้สร้างสภาพแวดล้อมที่ไม่เอื้ออำนวยหรือการรักษาล่าช้า มีการรายงานความกังวลเกี่ยวกับความเป็นพิษต่อเซลล์ในหลอดทดลองด้วยเงินหลายครั้ง 10,11 อย่างไรก็ตามความเป็นพิษต่อเซลล์ในหลอดทดลองยังไม่ได้แปลเป็นพิษในร่างกายและการแต่งกาย AG1+ หลายตัวได้แสดงให้เห็นถึงความปลอดภัยที่ดี 12
ที่นี่เราตรวจสอบประสิทธิผลของการแต่งกายของ carboxymethylcellulose ที่มีสูตรเงินใหม่กับแผ่นฟิล์มชีวภาพในหลอดทดลองและในร่างกาย นอกจากนี้ยังประเมินผลกระทบของการแต่งกายเหล่านี้ต่อการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันและการรักษาที่เป็นอิสระจากการติดเชื้อ
น้ำสลัดทั้งหมดที่ใช้มีวางจำหน่ายทั่วไป 3M Kerracel Gel Fiber Dressing (3M, Knutsford, UK) เป็นเครื่องแต่งกายที่ไม่ใช่แอร์บ็อกซ์จุลินทรีย์ 100% carboxymethylcellulose (CMC) การแต่งกายเจลที่ใช้เป็นชุดควบคุมในการศึกษานี้ มีการประเมินการแต่งกายด้วยยาต้านจุลชีพ CMC สามชุดคือ 3M Kerracel AG Dressing (3M, Knutsford, UK) ซึ่งมี 1.7 wt% เกลือสีเงินออกซิเจน (AG7NO11) ในไอออนซิลเวอร์วาเลนซ์ที่สูงขึ้น (AG1+, AG2+และ AG3+) ในระหว่างการสลายตัวของ AG7NO11, AG1+, AG2+ และ AG3+ ไอออนจะเกิดขึ้นในอัตราส่วน 1: 2: 4 Aquacel AG Dressing พิเศษที่มี 1.2% ซิลเวอร์คลอไรด์ (AG1+) (Convatec, Deeside, UK) 13 และ Aquacel AG+การแต่งตัวพิเศษที่มี 1.2% ซิลเวอร์คลอไรด์ (AG1+), EDTA และ Benzethonium คลอไรด์ (Convatec, Deeside, UK) 14
สายพันธุ์ที่ใช้ในการศึกษานี้คือ Pseudomonas aeruginosa NCTC 10781 (สาธารณสุขอังกฤษ, Salisbury) และ Staphylococcus aureus NCTC 6571 (สาธารณสุขอังกฤษ, Salisbury)
แบคทีเรียถูกปลูกข้ามคืนในน้ำซุปมุลเลอร์-ฮินตัน (Oxoid, Altrincham, สหราชอาณาจักร) วัฒนธรรมข้ามคืนได้รับการเจือจาง 1: 100 ในน้ำซุป Mueller-Hinton และ 200 µL ชุบลงบนเยื่อหุ้มเซลล์ Whatman Cyclopore (Whatman Plc, Maidstone, UK) บนแผ่น Mueller-Hinton Agar (Sigma-Aldrich Company LTD, Kent, Great Britain ). ) การก่อตัวของแผ่นชีวะโคโลเนียลที่ 37 ° C เป็นเวลา 24 ชั่วโมง แผ่นชีวะโคโลเนียลเหล่านี้ได้รับการทดสอบสำหรับการหดตัวลอการิทึม
ตัดน้ำสลัดออกเป็น 3 cm2 ตารางและ pre-moisten ด้วยน้ำปราศจากไอออนที่ผ่านการฆ่าเชื้อ วางผ้าพันแผลเหนือแผ่นชีวะของอาณานิคมบนแผ่นวุ้น ไบโอฟิล์มทุก ๆ 24 เฮกแตร์จะถูกลบออกและแบคทีเรียที่ทำงานได้ภายในแผ่นชีวะ (CFU/mL) ถูกวัดปริมาณโดยการเจือจางอนุกรม (10−1 ถึง 10−7) ในน้ำซุปการทำให้เป็นกลางในแต่ละวัน (Merck-Millipore) หลังจากการฟักตัว 24 ชั่วโมงที่ 37 ° C จำนวนแผ่นมาตรฐานจะถูกดำเนินการบนแผ่น Mueller-Hinton Agar การรักษาแต่ละครั้งและจุดเวลาดำเนินการเป็นสามเท่าและจำนวนแผ่นถูกทำซ้ำสำหรับการเจือจางแต่ละครั้ง
ผิวหมูสามชั้นได้มาจากหมูสีขาวตัวใหญ่ตัวเมียภายใน 15 นาทีหลังจากการสังหารตามมาตรฐานการส่งออกของสหภาพยุโรป ผิวหนังถูกโกนและทำความสะอาดด้วยผ้าเช็ดทำความสะอาดแอลกอฮอล์จากนั้นแช่แข็งที่อุณหภูมิ -80 ° C เป็นเวลา 24 ชั่วโมงเพื่อกำจัดผิวหนัง หลังจากการละลายแล้วชิ้นส่วนผิวหนัง 1 ซม. 2 ถูกล้างด้วย PBS สามครั้งโซเดียมไฮโปคลอไรต์ 0.6% และเอทานอล 70% เป็นเวลา 20 นาทีในแต่ละครั้ง ก่อนที่จะลบผิวหนังชั้นนอกให้ลบเอทานอลที่เหลืออยู่โดยการล้าง 3 ครั้งใน PBS ที่ผ่านการฆ่าเชื้อ ผิวหนังได้รับการเพาะเลี้ยงในจาน 6 หลุมที่มีเมมเบรนไนลอนหนา 0.45 μm (Merck-Millipore) ด้านบนและแผ่นรองรับ 3 แผ่น (Merck-Millipore) ที่มีเซรั่มในทารกในครรภ์ 3 มล. นกอินทรี ปานกลาง (Medified Eagle Medium ของ Dulbecco - Aldrich Ltd. )
แผ่นชีวะโคโลเนียลถูกปลูกตามที่อธิบายไว้สำหรับการศึกษาการสัมผัสแผ่นชีวะ หลังจากเพาะเลี้ยงฟิล์มชีวภาพบนเมมเบรนเป็นเวลา 72 ชั่วโมงแผ่นชีวะถูกนำไปใช้กับพื้นผิวโดยใช้ห่วงการฉีดวัคซีนที่ผ่านการฆ่าเชื้อและเมมเบรนถูกลบออก แผ่นชีวะนั้นถูกบ่มบนหนังแท้ของหมูอีก 24 ชั่วโมงที่ 37 ° C เพื่อให้ไบโอฟิล์มโตเต็มที่และยึดติดกับผิวของหมู หลังจากแผ่นฟิล์มชีวภาพได้ครบกำหนดและติดแล้วการแต่งกาย 1.5 ซม. 2, พุ่งเข้าหาน้ำกลั่นที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้วจะถูกนำไปใช้โดยตรงกับพื้นผิวและบ่มที่ 37 ° C เป็นเวลา 24 ชั่วโมง แบคทีเรียที่ทำงานได้ถูกมองเห็นได้โดยการย้อมสีโดยใช้น้ำยา Prestoblue Cell Wible Agent (Invitrogen, Life Technologies, Paisley, UK) ไปยังพื้นผิวปลายของการสำรวจแต่ละครั้งและบ่มเป็นเวลา 5 นาที ใช้กล้องดิจิตอล Leica DFC425 เพื่อถ่ายภาพบนกล้องจุลทรรศน์ Leica MZ8 ได้ทันที พื้นที่สีชมพูสีถูกหาปริมาณโดยใช้ซอฟต์แวร์ Pro Image รุ่น 10 (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD Image-Pro (MediaCy.com)) กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนสแกนได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ด้านล่าง
แบคทีเรียที่ปลูกในชั่วข้ามคืนถูกเจือจาง 1: 100 ในน้ำซุป Mueller-Hinton เพิ่มวัฒนธรรม 200 ไมโครลิตรลงในเยื่อหุ้มเซลล์ Whatman Cyclopore 0.2 μm (Whatman, Maidstone, UK) และชุบบน Mueller-Hinton Agar แผ่นฟิล์มชีวภาพถูกบ่มที่ 37 ° C เป็นเวลา 72 ชั่วโมงเพื่อให้เกิดการก่อตัวของฟิล์มชีวภาพที่ครบกำหนด
หลังจากการเจริญเติบโตของแผ่นชีวะ 3 วันผ้าพันแผล 3 ซม. สแควร์ถูกวางไว้บนแผ่นฟิล์มชีวภาพโดยตรงและบ่มที่ 37 ° C เป็นเวลา 24 ชั่วโมง หลังจากถอดผ้าพันแผลออกจากพื้นผิวแผ่นชีวะได้เพิ่ม 1 มิลลิลิตรของ Prestoblue เซลล์ที่มีชีวิตรีเอเจนต์ (Invitrogen, Waltham, MA) ลงในพื้นผิวของแผ่นชีวะแต่ละตัวเป็นเวลา 20 วินาที พื้นผิวถูกทำให้แห้งก่อนที่จะบันทึกการเปลี่ยนสีโดยใช้กล้องดิจิตอล Nikon D2300 (Nikon UK Ltd. , Kingston, UK)
เตรียมวัฒนธรรมข้ามคืนเกี่ยวกับ Mueller-Hinton Agar ถ่ายโอนอาณานิคมของแต่ละบุคคลไปยังน้ำซุป Mueller-Hinton 10 มล. และฟักบนเครื่องปั่นที่ 37 ° C (100 รอบต่อนาที) หลังจากการฟักตัวข้ามคืนวัฒนธรรมได้รับการเจือจาง 1: 100 ในน้ำซุป Mueller-Hinton และ 300 µL ถูกพบบนเมมเบรน Cyclopore Cyclopore Cyclopore 0.2 µm (Whatman International, Maidstone, UK) บน Mueller-Hinton Agar และบ่มที่ 37 ° C ภายใน 72 ชั่วโมง . - ฟิล์มชีวภาพที่ครบกำหนดถูกนำไปใช้กับแผลตามที่อธิบายไว้ด้านล่าง
ทำงานกับสัตว์ทั้งหมดได้ดำเนินการที่มหาวิทยาลัยแมนเชสเตอร์ภายใต้ใบอนุญาตโครงการที่ได้รับอนุมัติจากสำนักงานสวัสดิภาพสัตว์และการทบทวนจริยธรรม (p8721BD27) และเป็นไปตามแนวทางที่เผยแพร่โดยโฮมออฟฟิศภายใต้ ASPA ที่แก้ไขแล้ว 2012 ผู้เขียนทั้งหมดปฏิบัติตามแนวทางการมาถึง หนู C57BL/6J อายุแปดสัปดาห์ (Envigo, Oxon, UK) ใช้สำหรับการศึกษาทั้งหมดในวิฟ หนูถูกดมยาสลบด้วย isoflurane (Piramal Critical Care Ltd, West Drayton, UK) และพื้นผิวด้านหลังของพวกเขาถูกโกนและทำความสะอาด จากนั้นเมาส์แต่ละตัวจะได้รับแผล 2 × 6 มม. โดยใช้หมัดตรวจชิ้นเนื้อ stiefel (Schuco International, Hertfordshire, UK) สำหรับบาดแผลที่ติดเชื้อฟิล์มชีวภาพให้ใช้แผ่นฟิล์มอาณานิคม 72 ชั่วโมงที่ปลูกบนเยื่อหุ้มเซลล์ตามที่อธิบายไว้ข้างต้นกับชั้นผิวหนังของแผลโดยใช้ห่วงการฉีดวัคซีนที่ผ่านการฆ่าเชื้อทันทีหลังจากได้รับบาดเจ็บและทิ้งเมมเบรน การแต่งตัวหนึ่งเซนติเมตรหนึ่งตารางเซนติเมตรนั้นถูกทำให้ชุ่มด้วยน้ำที่ผ่านการฆ่าเชื้อเพื่อรักษาสภาพแวดล้อมที่ชื้น เครื่องแต่งกายถูกนำไปใช้โดยตรงกับแต่ละแผลและปกคลุมด้วยฟิล์ม Tegaderm 3M (3M, Bracknell, UK) และกาวเหลว Mastisol (Eloquest Healthcare, Ferndale, MI) ใช้รอบขอบเพื่อให้การยึดเกาะเพิ่มเติม Buprenorphine (AnimalCare, York, UK) ได้รับการบริหารที่ความเข้มข้น 0.1 mg/kg เป็นยาแก้ปวด เลือกหนูสามวันหลังจากได้รับบาดเจ็บโดยใช้วิธีการกำหนดตารางที่ 1 และลบลดครึ่งและเก็บพื้นที่แผลตามต้องการ
Hematoxylin (Thermofisher Scientific) และการย้อมสี Eosin (Thermofisher Scientific) ได้ดำเนินการตามโปรโตคอลของผู้ผลิต พื้นที่แผลและ reepithelialization ถูกหาปริมาณโดยใช้ซอฟต์แวร์ Image Pro เวอร์ชัน 10 (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD)
ส่วนเนื้อเยื่อถูก dewaxed ในไซลีน (Thermofisher Scientific, Loughborough, UK), คืนด้วยเอทานอลที่ให้คะแนน 100-50% และแช่ในน้ำปราศจากไอออน (Thermofisher Scientific) Immunohistochemistry ดำเนินการโดยใช้ชุด Vectastain Elite ABC PK-6104 (Vector Laboratories, Burlingame, CA) ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต แอนติบอดีปฐมภูมิไปยังนิวโทรฟิล NIMP-R14 (Thermofisher Scientific) และแมคโครฟาจ MS CD107B บริสุทธิ์ M3/84 (BD Biosciences, Wokingham, สหราชอาณาจักร) ถูกเจือจาง 1: 100 ในการบล็อกสารละลายและเพิ่มลงในพื้นผิวที่ถูกตัดตามด้วยแอนติบอดี 2 แอนติบอดี ABC และ Vector Nova Red Peroxidase (HRP) ชุดวัสดุ (Vector Laboratories, Burlingame, CA) และ counterstained ด้วย hematoxylin รูปภาพได้มาโดยใช้กล้องจุลทรรศน์ Olympus BX43 และกล้องดิจิตอล Olympus DP73 (Olympus, Southend-on-Sea, UK)
ตัวอย่างผิวหนังได้รับการแก้ไขในกลูตาราลดีไฮด์ 2.5% และฟอร์มัลดีไฮด์ 4% ใน 0.1 เมตรเฮปส์ (pH 7.4) เป็นเวลา 24 ชั่วโมงที่ 4 ° C ตัวอย่างถูกทำให้แห้งโดยใช้เอทานอลที่ให้คะแนนและแห้งใน CO2 โดยใช้เครื่องเป่าวิกฤตโควรัม K850 (Quorum Technologies Ltd, Loughton, UK) และสปัตเตอร์ที่เคลือบด้วยโลหะผสมทองคำอัลลอย ตัวอย่างถูกถ่ายภาพโดยใช้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบสแกน FEI Quanta 250 (Thermofisher Scientific) เพื่อให้เห็นภาพจุดศูนย์กลางของแผล
Toto-1 ไอโอไดด์ (2 μm) ถูกนำไปใช้กับพื้นผิวแผลเมาส์ที่ถูกตัดออกและบ่มเป็นเวลา 5 นาทีที่ 37 ° C (Thermofisher Scientific) และรักษาด้วย Syto-60 (10 μm) ที่ 37 ° C (Thermofisher Scientific) ภาพ z-stack 15 นาทีถูกสร้างขึ้นโดยใช้ Leica TCS SP8
ข้อมูลการทำซ้ำทางชีวภาพและทางเทคนิคได้รับการจัดตารางและวิเคราะห์โดยใช้ซอฟต์แวร์ GraphPad Prism V9 (ซอฟต์แวร์ GraphPad, La Jolla, CA) การวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียวกับการเปรียบเทียบหลายครั้งโดยใช้การทดสอบหลังการทดสอบของ Dunnett ใช้เพื่อทดสอบความแตกต่างระหว่างการรักษาแต่ละครั้ง ค่า P <0.05 ถือว่ามีนัยสำคัญ
ประสิทธิผลของการแต่งตัวเส้นใยสีเงินได้รับการประเมินครั้งแรกกับอาณานิคมไบโอฟิล์มของ Staphylococcus aureus และ Pseudomonas aeruginosa ในหลอดทดลอง น้ำสลัดสีเงินมีสูตรที่แตกต่างกันของเงิน: น้ำสลัดเงินแบบดั้งเดิมผลิต Ag1+ ไอออน; น้ำสลัดสีเงินซึ่งสามารถผลิต AG1+ ไอออนหลังจากการเติม EDTA/BC สามารถทำลายเมทริกซ์ฟิล์มชีวภาพและเปิดเผยแบคทีเรียให้เป็นเงินภายใต้ผลการต้านเชื้อแบคทีเรียของเงิน IONS15 และน้ำสลัดที่มีเกลือ AG ออกซิเจนที่ผลิต AG1+, AG2+ และ AG3+ ไอออน ประสิทธิผลของมันถูกนำมาเปรียบเทียบกับการแต่งตัวที่ไม่ใช้ยาเสพติดที่ทำจากเส้นใยเจล แบคทีเรียที่มีศักยภาพที่เหลืออยู่ภายในแผ่นชีวะได้รับการประเมินทุก 24 ชั่วโมงเป็นเวลา 8 วัน (รูปที่ 1) ในวันที่ 5 แผ่นฟิล์มชีวภาพได้รับการเชื่อมต่อใหม่ด้วย 3.85 × 105s Staphylococcus aureus หรือ 1.22 × 105p aeruginosa เพื่อประเมินการกู้คืนฟิล์มชีวภาพ เมื่อเปรียบเทียบกับการแต่งกายที่ไม่ได้รับการควบคุมโดยแอนตี้จุลินทรีย์แล้วเครื่องแต่งกาย AG1+ มีผลต่อความมีชีวิตของแบคทีเรียใน Staphylococcus aureus และ Pseudomonas aeruginosa Biofilms ในระยะเวลา 5 วัน ในทางตรงกันข้ามน้ำสลัดที่มีเกลือออกซิเจนและ AG1 + + EDTA/BC มีประสิทธิภาพในการฆ่าแบคทีเรียภายในแผ่นฟิล์มชีวภาพภายใน 5 วัน หลังจากการฉีดวัคซีนซ้ำด้วยแบคทีเรียแพลงก์ตอนในวันที่ 5 ไม่พบการฟื้นฟูแผ่นชีวะ (รูปที่ 1)
ปริมาณของแบคทีเรียที่ทำงานได้ใน Staphylococcus aureus และ Pseudomonas aeruginosa biofilms หลังการรักษาด้วยน้ำสลัด อาณานิคมไบโอฟิล์มของ Staphylococcus aureus และ Pseudomonas aeruginosa ได้รับการรักษาด้วยน้ำสลัดสีเงินหรือเครื่องแต่งกายควบคุมที่ไม่ใช่เครื่องราชอิสริยาภรณ์และจำนวนแบคทีเรียที่เหลืออยู่ถูกกำหนดทุก 24 ชั่วโมง หลังจาก 5 วันแผ่นฟิล์มชีวภาพจะถูกเชื่อมใหม่ด้วย 3.85 × 105s Staphylococcus aureus หรือ 1.22 × 105p อาณานิคมของ Bacterioplankton Pseudomonas aeruginosa ถูกสร้างขึ้นเป็นรายบุคคลเพื่อประเมินการกู้คืนฟิล์มชีวภาพ กราฟแสดงค่าเฉลี่ย +/- ข้อผิดพลาดมาตรฐาน
เพื่อแสดงให้เห็นถึงผลกระทบของน้ำสลัดสีเงินที่มีต่อความมีชีวิตทางชีวภาพการแต่งกายถูกนำไปใช้กับแผ่นชีวะที่โตขึ้นบนผิวหนัง หลังจาก 24 ชั่วโมงการแต่งกายจะถูกลบออกและแผ่นชีวะจะถูกย้อมด้วยสีย้อมปฏิกิริยาสีน้ำเงินซึ่งถูกเผาผลาญโดยแบคทีเรียที่มีชีวิตเป็นสีชมพู แผ่นชีวะที่ได้รับการบำบัดด้วยเครื่องสำอางเป็นสีชมพูแสดงให้เห็นถึงการปรากฏตัวของแบคทีเรียที่ทำงานได้ภายในแผ่นฟิล์มชีวภาพ (รูปที่ 2A) ในทางตรงกันข้ามแผ่นชีวะที่ได้รับการรักษาด้วยการแต่งตัว Ag oxysols นั้นเป็นสีน้ำเงินเป็นหลักแสดงให้เห็นว่าแบคทีเรียที่เหลืออยู่บนพื้นผิวของผิวหมูเป็นแบคทีเรียที่ไม่น่าเชื่อถือ (รูปที่ 2B) สีฟ้าและสีชมพูผสมถูกพบในแผ่นชีวะที่ได้รับการรักษาด้วยเครื่องแต่งกาย AG1+-ที่มีอยู่ซึ่งบ่งชี้ว่ามีแบคทีเรียที่ทำงานได้และไม่สามารถทำงานได้ภายในแผ่นฟิล์มชีวภาพ (รูปที่ 2C) ในขณะที่เครื่องแต่งกาย EDTA/BC ที่มี AG1+ เป็นสีน้ำเงินส่วนใหญ่มีจุดสีชมพูบางจุด การระบุพื้นที่ที่ไม่ได้รับผลกระทบจากการแต่งตัวเงิน (รูปที่ 2D) ปริมาณของพื้นที่แอคทีฟ (สีชมพู) และพื้นที่ที่ไม่ได้ใช้งาน (สีน้ำเงิน) แสดงให้เห็นว่าแพทช์ควบคุมมีการใช้งาน 75% (รูปที่ 2E) AG1 + + EDTA/BC Dressings ดำเนินการคล้ายกับน้ำสลัด AG AG ออกซิเจนโดยมีอัตราการรอดชีวิต 13% และ 14% ตามลำดับ การแต่งตัว AG1+ ยังลดความมีชีวิตของแบคทีเรียลง 21% แผ่นชีวะเหล่านี้ถูกตรวจพบโดยใช้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบสแกน (SEM) หลังการรักษาด้วยชุดควบคุมและการแต่งตัว AG1+, ชั้นของ pseudomonas aeruginosa ถูกสังเกตว่าครอบคลุมผิวสุกร (รูปที่ 2f, h) ในขณะที่หลังการรักษาด้วยการแต่งกายด้วย Ag1+, เซลล์แบคทีเรียไม่กี่เซลล์และพบเซลล์แบคทีเรียเพียงไม่กี่เซลล์ เส้นใยคอลลาเจนถือได้ว่าเป็นโครงสร้างเนื้อเยื่อของผิวสุกร (รูปที่ 2G) หลังการรักษาด้วยการแต่งตัว AG1 + + EDTA/BC โล่แบคทีเรียและโล่เส้นใยคอลลาเจนพื้นฐานสามารถมองเห็นได้ (รูปที่ 2I)
การสร้างภาพข้อมูลของ Biofilm Pseudomonas aeruginosa หลังการแต่งกายด้วยเงิน (A-D) ความมีชีวิตของแบคทีเรียใน Pseudomonas aeruginosa biofilms ที่ปลูกบนผิวสุกรถูกมองเห็นโดยใช้สีย้อม Prestoblue ย้อม 24 ชั่วโมงหลังการรักษาด้วยน้ำสลัดสีเงิน แบคทีเรียที่มีชีวิตคือสีชมพูแบคทีเรียที่ไม่สามารถทำงานได้และผิวหมูเป็นสีน้ำเงิน (e) ปริมาณของ Pseudomonas aeruginosa biofilms ที่ปลูกบนผิวสุกร (จุดสีชมพู) โดยใช้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนสแกน Pro เวอร์ชัน 10 (FI) และรักษาด้วยน้ำสลัดสีเงิน แถบสเกล SEM = 5 µm (J - M) แผ่นชีวะโคโลเนียลเติบโตบนตัวกรองและถูกย้อมด้วยสีย้อมปฏิกิริยา Prestoblue หลังจากการบ่ม 24 ชั่วโมงด้วยน้ำสลัดสีเงิน
เพื่อตรวจสอบว่าการสัมผัสอย่างใกล้ชิดระหว่างน้ำสลัดและแผ่นชีวะส่งผลกระทบต่อประสิทธิภาพของการแต่งกายแผ่นชีวภาพอาณานิคมที่วางอยู่บนพื้นผิวเรียบได้รับการบำบัดด้วยน้ำสลัดเป็นเวลา 24 ชั่วโมงแล้วย้อมด้วยสีย้อมปฏิกิริยา แผ่นฟิล์มชีวภาพที่ไม่ได้รับการรักษาคือสีชมพูเข้ม (รูปที่ 2J) ตรงกันข้ามกับแผ่นชีวะที่ได้รับการบำบัดด้วยน้ำสลัดที่มีเกลือ Ag ออกซิเจน (รูปที่ 2K), แผ่นชีวะที่ได้รับการบำบัดด้วยน้ำสลัดที่มี AG1+ หรือ AG1++ EDTA/BC แสดงแถบการย้อมสีชมพู (รูปที่ 2L, M) สีชมพูนี้บ่งบอกถึงการมีแบคทีเรียที่มีศักยภาพและเกี่ยวข้องกับพื้นที่รอยประสานภายในการแต่งกาย พื้นที่เย็บเหล่านี้สร้างพื้นที่ตายที่อนุญาตให้แบคทีเรียภายในแผ่นฟิล์มชีวภาพอยู่รอดได้
เพื่อประเมินประสิทธิภาพของน้ำสลัดสีเงินในวิฟความหนาเต็มบาดแผลของหนูที่ติดเชื้อ S. aureus และ P. aeruginosa biofilms ได้รับการรักษาด้วยเครื่องแต่งกายควบคุม nonantimicrobial หรือน้ำสลัดเงิน หลังจาก 3 วันของการรักษาการวิเคราะห์ภาพด้วยกล้องจุลทรรศน์แสดงให้เห็นขนาดแผลที่เล็กลงเมื่อได้รับการบำบัดด้วยน้ำสลัดออกซิเจนเมื่อเทียบกับเครื่องแต่งกายควบคุมที่ไม่ใช่ยาเสพติดและน้ำสลัดเงินอื่น ๆ (รูปที่ 3A-H) เพื่อยืนยันการสังเกตเหล่านี้บาดแผลถูกเก็บเกี่ยวและพื้นที่แผลและการทำให้เป็นจำนวนมากในส่วนของเนื้อเยื่อ hematoxylin และ eosin-stained โดยใช้ซอฟต์แวร์ Image Pro เวอร์ชัน 10 (รูปที่ 3I-L)
ผลของการแต่งตัวสีเงินบนพื้นผิวแผลและการทำให้เป็นแผลซ้ำของบาดแผลที่ติดเชื้อแผ่นชีวะ (A - H) เซลล์ขนาดเล็กที่ติดเชื้อ Biofilms ของ Pseudomonas aeruginosa (A - D) และ Staphylococcus aureus (E -H) หลังจากสามวันของการรักษาด้วยการแต่งตัวแบบ nonantimicrobial น้ำสลัด ภาพแมคโครสโคปที่เป็นตัวแทน บาดแผลของหนูที่มีการแต่งตัว AG1 + + EDTA/BC (IL) การติดเชื้อ Pseudomonas aeruginosa, ส่วนทางเนื้อเยื่อวิทยาที่ย้อมด้วย hematoxylin และ eosin, ใช้ในการหาปริมาณพื้นที่แผลและการฟื้นฟูเยื่อบุผิว ปริมาณของพื้นที่แผล (M, O) และเปอร์เซ็นต์ reepithelialization (n, p) ของแผลที่ติดเชื้อ Pseudomonas aeruginosa (M, N) และ Staphylococcus aureus (O, P) Biofilms (ต่อกลุ่มการรักษา N = 12) กราฟแสดงค่าเฉลี่ย +/- ข้อผิดพลาดมาตรฐาน * หมายถึง p = <0.05 ** หมายถึง p = <0.01; มาตราส่วนขนาดมหึมา = 2.5 มม., สเกลทางเนื้อเยื่อวิทยา = 500 µm
การหาปริมาณของพื้นที่แผลในบาดแผลที่ติดเชื้อ Biofilm Pseudomonas aeruginosa (รูปที่ 3M) แสดงให้เห็นว่าบาดแผลที่ได้รับการรักษาด้วย Ag oxysalts มีขนาดแผลเฉลี่ย 2.5 mm2 ในขณะที่การควบคุมที่ไม่ได้รับการควบคุม จริง. ถึงนัยสำคัญทางสถิติ (รูปที่ 3M) p = 0.423) บาดแผลที่ได้รับการรักษาด้วย AG1+ หรือ AG1++ EDTA/BC แสดงให้เห็นว่าไม่มีการลดลงของพื้นที่แผล (3.1 mm2 และ 3.6 mm2 ตามลำดับ) การรักษาด้วยการแต่งตัวเกลือ AG ออกซิเจนส่งเสริมการเพิ่มขึ้นอีกครั้งในระดับที่สูงกว่าการแต่งกายที่ไม่ได้รับการควบคุม (34% และ 15% ตามลำดับ; P = 0.029) และ AG1+ หรือ AG1++ EDTA/BC (10% และ 11%) ( รูปที่ 3N) - ตามลำดับ)
แนวโน้มที่คล้ายกันในพื้นที่แผลและการฟื้นฟูเยื่อบุผิวถูกพบในบาดแผลที่ติดเชื้อ Biofilms S. aureus (รูปที่ 3O) น้ำสลัดที่มีเกลือเงินออกซิเจนลดลงพื้นที่แผล (2.0 มม. 2) 23% เมื่อเทียบกับการควบคุมการแต่งตัวที่ไม่ใช่เครื่องดื่ม (2.6 มม. 2) แม้ว่าการลดลงนี้ไม่สำคัญ (p = 0.304) (รูปที่ 3O) นอกจากนี้พื้นที่แผลในกลุ่มการรักษา AG1+ ลดลงเล็กน้อย (2.4 mm2) ในขณะที่แผลที่ได้รับการรักษาด้วยการแต่งตัว AG1++ EDTA/BC ไม่ได้ลดพื้นที่แผล (2.9 mm2) เกลือออกซิเจนของ AG ยังส่งเสริมการเกิดแผลซ้ำของบาดแผลที่ติดเชื้อ Biofilm S. aureus (31%) ในระดับที่สูงกว่าที่ได้รับการรักษาด้วยเครื่องแต่งกายที่ไม่ใช่เครื่องราช Ag1+ dressing (16%, p = 0.903) และ Ag+ 1+ dressing EDTA/BC (14%, p = 0.965) แสดงระดับของการฟื้นฟูเยื่อบุผิวคล้ายกับการควบคุม
เพื่อแสดงให้เห็นถึงผลกระทบของน้ำสลัดสีเงินในเมทริกซ์ฟิล์มชีวภาพ Toto 1 และ Syto 60 การย้อมสีไอโอไดด์ได้ดำเนินการ (รูปที่ 4) Toto 1 iodide เป็นสีย้อมที่สามารถใช้งานได้ซึ่งสามารถใช้ในการมองเห็นกรดนิวคลีอิกนอกเซลล์อย่างแม่นยำซึ่งมีอยู่มากมายใน EPS ของแผ่นชีวะ Syto 60 เป็นสีย้อมที่ดูดซึมได้ของเซลล์ที่ใช้เป็น counterstain16 การสังเกตของ toto 1 และ syto 60 ไอโอไดด์ในบาดแผลที่ฉีดวัคซีนด้วยแผ่นชีวะของ Pseudomonas aeruginosa (รูปที่ 4A-D) และ Staphylococcus aureus (รูปที่ 4I-L) แสดงให้เห็นว่าหลังจาก 3 วันของการแต่งกาย มีเกลือออกซิเจน AG และ AG1 + + EDTA/BC AG1+ เครื่องแต่งกายที่ไม่มีส่วนประกอบ antibiofilm เพิ่มเติมลด DNA ที่ปราศจากเซลล์อย่างมีนัยสำคัญในบาดแผลที่ฉีดวัคซีนด้วย pseudomonas aeruginosa แต่มีประสิทธิภาพน้อยกว่าในบาดแผลที่ฉีดวัคซีนด้วย Staphylococcus aureus
ในการถ่ายภาพวิฟของแผ่นฟิล์มชีวภาพหลังจาก 3 วันของการรักษาด้วยการควบคุมหรือน้ำสลัดสีเงิน ภาพ confocal ของ Pseudomonas aeruginosa (A - D) และ Staphylococcus aureus (I - L) ย้อมด้วย TOTO 1 (สีเขียว) เพื่อแสดงให้เห็นถึงกรดนิวคลีอิกนอกเซลล์ซึ่งเป็นส่วนประกอบของโพลิเมอร์ชีวภาพนอกเซลล์ หากต้องการเปื้อนกรดนิวคลีอิกภายในเซลล์ให้ใช้ Syto 60 (สีแดง) กรด P. การสแกนกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนของบาดแผลที่ติดเชื้อ Pseudomonas aeruginosa (E -H) และ Staphylococcus aureus (M - P) แผ่นชีวะหลังจาก 3 วันของการรักษาด้วยการควบคุมและน้ำสลัด แถบสเกล SEM = 5 µm แถบสเกลการถ่ายภาพ confocal = 50 µm
การสแกนด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแสดงให้เห็นว่าหนูที่ฉีดวัคซีนด้วยไบโอฟิล์มอาณานิคมของ Pseudomonas aeruginosa (รูปที่ 4E-H) และ Staphylococcus aureus (รูปที่ 4M-P) มีแบคทีเรียน้อยลงอย่างมีนัยสำคัญหลังจากการรักษาด้วยเงินทั้งหมด 3 วัน
เพื่อประเมินผลกระทบของน้ำสลัดสีเงินต่อการอักเสบของแผลในหนูที่ติดเชื้อฟิล์มชีวภาพส่วนของบาดแผลที่ติดเชื้อฟิล์มชีวภาพที่ได้รับการรักษาด้วยการควบคุมหรือน้ำสลัดสีเงินเป็นเวลา 3 วันคือการย้อมสีด้วยภูมิคุ้มกันโดยใช้แอนติบอดีจำเพาะสำหรับนิวโทรฟิลและแมคโครฟาจ การกำหนดเชิงปริมาณของนิวโทรฟิลและแมคโครฟาจภายใน เนื้อเยื่อเม็ด รูปที่ 5) น้ำสลัดสีเงินทั้งหมดลดจำนวนนิวโทรฟิลและแมคโครฟาจในบาดแผลที่ติดเชื้อ Pseudomonas aeruginosa เมื่อเทียบกับเครื่องแต่งกายควบคุมที่ไม่ใช่เครื่องราชอิสริยาภรณ์หลังจากการรักษาสามวัน อย่างไรก็ตามการรักษาด้วยการแต่งตัวเกลือสีเงินออกซิเจนส่งผลให้นิวโทรฟิลลดลงมากขึ้น (p = <0.0001) และแมคโครฟาจ (p = <0.0001) เมื่อเทียบกับเครื่องแต่งกายเงินอื่น ๆ ที่ทดสอบ (รูปที่ 5i, j) แม้ว่า AG1++ EDTA/BC มีผลกระทบต่อแผ่นฟิล์มชีวภาพมากขึ้น แต่ก็ลดระดับนิวโทรฟิลและระดับแมคโครฟาจในระดับที่น้อยกว่าการแต่งตัว AG1+ บาดแผลปานกลางที่ติดเชื้อ Biofilm S. aureus ก็ถูกสังเกตหลังจากแต่งตัวด้วย Ag (P = <0.0001), Ag1+ (P = 0.0008) และ AG1 ++ EDTA/BC (P = 0.0043) oxisols เมื่อเทียบกับการควบคุม มีแนวโน้มที่คล้ายกันสำหรับนิวโทรฟิเนีย ผ้าพันแผล (รูปที่ 5K) อย่างไรก็ตามมีเพียงการแต่งตัวเกลือ AG ออกซิเจนเท่านั้นที่มีการลดลงอย่างมีนัยสำคัญในจำนวนของแมคโครฟาจในเนื้อเยื่อแกรนูลเมื่อเทียบกับการควบคุมในบาดแผลที่ติดเชื้อ Biofilms S. aureus (P = 0.0339) (รูปที่ 5L)
นิวโทรฟิลและแมคโครฟาจถูกหาปริมาณในบาดแผลที่ติดเชื้อ Pseudomonas aeruginosa และ Staphylococcus aureus biofilms หลังจาก 3 วันของการรักษาด้วยการควบคุมที่ไม่ใช่ยาเสพติดหรือเครื่องแต่งกายเงิน นิวโทรฟิล (AD) และแมคโครฟาจ (EH) ถูกหาปริมาณในส่วนเนื้อเยื่อที่ย้อมด้วยแอนติบอดีเฉพาะสำหรับนิวโทรฟิลหรือแมคโครฟาจ ปริมาณของนิวโทรฟิล (I และ K) และแมคโครฟาจ (J และ L) ในบาดแผลที่ติดเชื้อ Pseudomonas aeruginosa (I และ J) และ Staphylococcus aureus (K&L) Biofilms n = 12 ต่อกลุ่ม กราฟแสดงค่าเฉลี่ย +/- ข้อผิดพลาดมาตรฐานค่านัยสำคัญเมื่อเทียบกับการแต่งตัวที่ไม่ใช่แอนติบอดี * หมายถึง p = <0.05, ** หมายถึง p = <0.01; *** หมายถึง p = <0.001; ระบุ p = <0.0001)
จากนั้นเราประเมินผลของการแต่งกายด้วยเงินต่อการรักษาที่ไม่ขึ้นกับการติดเชื้อ บาดแผล excisional ที่ไม่ติดเชื้อได้รับการรักษาด้วยการแต่งตัวที่ไม่ได้รับการควบคุมจากยาเสพติดหรือน้ำสลัดสีเงินเป็นเวลา 3 วัน (รูปที่ 6) ในบรรดาเครื่องแต่งกายสีเงินที่ผ่านการทดสอบมีเพียงบาดแผลที่ได้รับการรักษาด้วยน้ำสลัดออกซิเจนที่มีออกซิเจนจะมีขนาดเล็กลงบนภาพ macroscopic กว่าบาดแผลที่ได้รับการควบคุม (รูปที่ 6A-D) ปริมาณของพื้นที่แผลโดยใช้การวิเคราะห์ทางเนื้อเยื่อวิทยาแสดงให้เห็นว่าพื้นที่แผลเฉลี่ยหลังการรักษาด้วยการแต่งตัว Ag oxysols คือ 2.35 mm2 เมื่อเทียบกับ 2.96 mm2 สำหรับบาดแผลที่ได้รับการรักษาด้วยกลุ่มควบคุม แต่ความแตกต่างนี้ไม่ถึงนัยสำคัญทางสถิติ (p = 0.488) (รูปที่ . 6i) ในทางตรงกันข้ามไม่พบการลดลงของพื้นที่แผลหลังการรักษาด้วย AG1+ (3.38 mm2, p = 0.757) หรือ AG1++ EDTA/BC (4.18 mm2, p = 0.054) เครื่องแต่งกายเมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม การฟื้นฟูเยื่อบุผิวที่เพิ่มขึ้นนั้นเกิดขึ้นกับการแต่งตัว Ag oxysol เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม (30% เทียบกับ 22% ตามลำดับ) แม้ว่าสิ่งนี้จะไม่ถึงนัยสำคัญ (p = 0.067) สิ่งนี้ค่อนข้างสำคัญและยืนยันผลลัพธ์ก่อนหน้านี้ การแต่งกายด้วย oxysols ส่งเสริมการขยายตัวอีกครั้ง -Epithelization ของบาดแผลที่ไม่ติดเชื้อ 17 ในทางตรงกันข้ามการรักษาด้วยการแต่งกายด้วย AG1+ หรือ AG1++ EDTA/BC ไม่มีผลหรือแสดงให้เห็นว่าการขยายตัวอีกครั้งเมื่อเทียบกับการควบคุม
ผลของการแต่งตัวบาดแผลสีเงินต่อการรักษาแผลในหนูที่ไม่ติดเชื้อพร้อมการผ่าตัดที่สมบูรณ์ (AD) ภาพที่เป็นตัวแทนของบาดแผลของบาดแผลหลังจากสามวันของการรักษาด้วยการแต่งตัวที่ไม่ได้รับการควบคุมและน้ำสลัดสีเงิน (EH) ส่วนที่เป็นตัวแทนแผลย้อมด้วย hematoxylin และ eosin ปริมาณของพื้นที่แผล (I) และเปอร์เซ็นต์ของ reepithelialization (J) คำนวณจากส่วนทางเนื้อเยื่อวิทยาที่จุดกึ่งกลางของแผลโดยใช้ซอฟต์แวร์การวิเคราะห์ภาพ (n = 11–12 ต่อกลุ่มการรักษา) กราฟแสดงค่าเฉลี่ย +/- ข้อผิดพลาดมาตรฐาน * หมายถึง p = <0.05
เงินมีประวัติการใช้มายาวนานในการรักษาด้วยยาต้านจุลชีพในการรักษาแผล แต่สูตรและวิธีการส่งมอบที่แตกต่างกันมากมายอาจส่งผลให้เกิดความแตกต่างในประสิทธิภาพของยาต้านจุลชีพ 18 ยิ่งไปกว่านั้นคุณสมบัติของแอนติบิโอฟิล์มของระบบการส่งเงินที่เฉพาะเจาะจงยังไม่เป็นที่เข้าใจอย่างสมบูรณ์ แม้ว่าการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกันของโฮสต์นั้นค่อนข้างมีประสิทธิภาพต่อแบคทีเรียแพลงก์ตอน แต่โดยทั่วไปจะมีประสิทธิภาพน้อยกว่า Biofilms19 แบคทีเรียแพลงก์ตอนนั้นเป็น phagocytosed โดยแมคโครฟาจ แต่ภายในแผ่นชีวะเซลล์รวมมีปัญหาเพิ่มเติมโดยการ จำกัด การตอบสนองของโฮสต์ในขอบเขตที่เซลล์ภูมิคุ้มกันสามารถผ่านการตายของเซลล์ พบว่าเม็ดเลือดขาวบางชนิดสามารถเจาะ biofilms21 ได้ แต่ไม่สามารถแบคทีเรีย phagocytose ได้เมื่อการป้องกันนี้ถูกบุกรุก 21 ควรใช้วิธีการแบบองค์รวมเพื่อสนับสนุนการตอบสนองของภูมิคุ้มกันของโฮสต์ต่อการติดเชื้อฟิล์มชีวภาพ การทำลายล้างแผลสามารถรบกวนไบโอฟิล์มและกำจัด bioburden ส่วนใหญ่ได้ แต่การตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกันของโฮสต์อาจไม่ได้ผลต่อไบโอฟิล์มที่เหลืออยู่โดยเฉพาะอย่างยิ่งหากการตอบสนองของภูมิคุ้มกันของโฮสต์ถูกบุกรุก ดังนั้นการรักษาด้วยยาต้านจุลชีพเช่นน้ำสลัดสีเงินสามารถรองรับการตอบสนองของภูมิคุ้มกันของโฮสต์และกำจัดการติดเชื้อฟิล์มชีวภาพ องค์ประกอบความเข้มข้นความสามารถในการละลายและการจัดส่งสามารถมีอิทธิพลต่อประสิทธิภาพของยาต้านจุลชีพของเงิน ในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมาความก้าวหน้าในเทคโนโลยีการประมวลผลเงินทำให้การแต่งกายเหล่านี้มีประสิทธิภาพมากขึ้น 9,23 ในขณะที่เทคโนโลยีการแต่งตัวเงินมีความสำคัญเป็นสิ่งสำคัญที่จะต้องเข้าใจประสิทธิภาพของเครื่องแต่งกายเหล่านี้ในการควบคุมการติดเชื้อที่แผลและที่สำคัญกว่านั้นคือผลกระทบของเงินที่มีศักยภาพเหล่านี้ต่อสภาพแวดล้อมของแผลและการรักษา
ในการศึกษานี้เราเปรียบเทียบประสิทธิภาพของการแต่งกายเงินขั้นสูงสองชุดกับน้ำสลัดสีเงินทั่วไปที่ผลิต Ag1+ ไอออนกับแผ่นชีวะโดยใช้หลอดทดลองและในรูปแบบวิฟ นอกจากนี้เรายังประเมินผลกระทบของการแต่งกายเหล่านี้ต่อสภาพแวดล้อมแผลและการรักษาที่ไม่ขึ้นกับการติดเชื้อ เพื่อลดอิทธิพลของเมทริกซ์การส่งมอบเครื่องแต่งกายเงินทั้งหมดที่ผ่านการทดสอบประกอบด้วย carboxymethylcellulose
การประเมินเบื้องต้นของเราเกี่ยวกับการแต่งตัวเงินเหล่านี้กับแผ่นชีวะโคโลเนียลของ Pseudomonas aeruginosa และ Staphylococcus aureus แสดงให้เห็นว่าไม่เหมือนกับการแต่งกายแบบดั้งเดิม Ag1+ แบบดั้งเดิม, น้ำสลัดเงินขั้นสูง, AG1++ EDTA/BC และเกลือ AG ออกซิเจน ไม่กี่วัน นอกจากนี้เครื่องแต่งกายเหล่านี้ป้องกันการก่อตัวของแผ่นชีวะใหม่เมื่อสัมผัสกับแบคทีเรียแพลงก์ตอนซ้ำ การแต่งตัว Ag1+ มีซิลเวอร์คลอไรด์สารประกอบเงินและเมทริกซ์พื้นฐานเดียวกันกับ Ag1++ EDTA/BC และมีผล จำกัด ต่อความมีชีวิตของแบคทีเรียภายในแผ่นฟิล์มชีวภาพในช่วงเวลาเดียวกัน การสังเกตว่าการแต่งตัว AG1++ EDTA/BC นั้นมีประสิทธิภาพมากกว่า biofilm มากกว่าการแต่งกาย Ag1+ ซึ่งประกอบด้วยเมทริกซ์เดียวกันและสารประกอบเงินสนับสนุนความคิดที่ว่าส่วนผสมเพิ่มเติมจะต้องเพิ่มประสิทธิภาพของซิลเวอร์คลอไรด์กับไบโอฟิล์มตามที่ได้รับการรายงาน ที่อื่น 15 ผลลัพธ์เหล่านี้สนับสนุนแนวคิดที่ว่า BC และ EDTA มีบทบาทเพิ่มเติมที่มีส่วนทำให้เกิดประสิทธิภาพการแต่งตัวโดยรวมและการขาดส่วนประกอบนี้ในการแต่งกาย Ag1+ อาจมีส่วนทำให้เกิดความล้มเหลวในการแสดงให้เห็นถึงประสิทธิภาพในหลอดทดลอง เราพบว่าการแต่งตัวเกลือ AG ออกซิเจนที่ผลิต AG2+ และ AG3+ ไอออนแสดงประสิทธิภาพต้านเชื้อแบคทีเรียที่แข็งแกร่งกว่า AG1+ และในระดับที่คล้ายกับ AG1++ EDTA/BC อย่างไรก็ตามเนื่องจากศักยภาพในการรีดอกซ์สูงจึงไม่มีความชัดเจนว่า Ag3+ ไอออนยาวเท่าใดยังคงทำงานอยู่และมีประสิทธิภาพต่อแผ่นชีวะแผลและดังนั้นจึงได้รับการศึกษาเพิ่มเติม นอกจากนี้ยังมีการแต่งกายที่แตกต่างกันมากมายที่สร้าง AG1+ ไอออนที่ไม่ได้ทดสอบในการศึกษานี้ การแต่งกายเหล่านี้ประกอบด้วยสารประกอบเงินความเข้มข้นและเมทริกซ์ฐานที่แตกต่างกันซึ่งอาจมีผลต่อการส่งมอบ Ag1+ ไอออนและประสิทธิภาพของพวกเขาต่อแผ่นชีวะ นอกจากนี้ยังเป็นที่น่าสังเกตว่ามีหลายรูปแบบในหลอดทดลองและในร่างกายที่ใช้ในการประเมินประสิทธิภาพของการแต่งหน้าแผลจากแผ่นชีวะ ประเภทของแบบจำลองที่ใช้เช่นเดียวกับปริมาณเกลือและโปรตีนของสื่อที่ใช้ในแบบจำลองเหล่านี้จะมีผลต่อประสิทธิภาพของการแต่งตัว ในแบบจำลองในวิฟของเราเราอนุญาตให้ฟิล์มชีวภาพเติบโตในหลอดทดลองแล้วถ่ายโอนไปยังพื้นผิวผิวหนังของแผล การตอบสนองของภูมิคุ้มกันของหนูโฮสต์นั้นค่อนข้างมีประสิทธิภาพต่อแบคทีเรียแพลงก์ตอนที่ใช้กับแผลซึ่งจะสร้างแผ่นชีวะเมื่อแผลหาย การเพิ่มแผ่นฟิล์มชีวภาพที่เป็นผู้ใหญ่ไปยังแผล จำกัด ประสิทธิภาพของการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกันของโฮสต์ต่อการก่อตัวของแผ่นฟิล์มชีวภาพโดยการอนุญาตให้แผ่นชีวะที่เป็นผู้ใหญ่สามารถสร้างตัวเองภายในแผลก่อนที่การรักษาจะเริ่มขึ้น ดังนั้นแบบจำลองของเราช่วยให้เราสามารถประเมินประสิทธิภาพของการแต่งกายด้วยยาต้านจุลชีพในแผ่นชีวะผู้ใหญ่ก่อนที่บาดแผลจะเริ่มหาย
นอกจากนี้เรายังพบว่าความพอดีของการแต่งตัวมีผลต่อประสิทธิภาพของน้ำสลัดสีเงินในแผ่นชีวะที่ปลูกในหลอดทดลองและผิวสุกร การสัมผัสอย่างใกล้ชิดกับแผลถือเป็นสิ่งสำคัญสำหรับประสิทธิภาพของยาต้านจุลชีพของการแต่งตัว 24,25 น้ำสลัดที่มีเกลือ Ag ออกซิเจนสัมผัสกับแผ่นชีวะที่ครบกำหนดส่งผลให้จำนวนแบคทีเรียที่ทำงานได้ลดลงอย่างมีนัยสำคัญภายในแผ่นฟิล์มชีวภาพหลังจาก 24 ชั่วโมง ในทางตรงกันข้ามเมื่อได้รับการรักษาด้วยการแต่งตัว Ag1+ และ Ag1++ EDTA/BC จำนวนแบคทีเรียที่มีชีวิตยังคงอยู่ น้ำสลัดเหล่านี้มีการเย็บด้วยความยาวทั้งหมดของการแต่งกายซึ่งสร้างพื้นที่ตายซึ่งป้องกันการสัมผัสกับแผ่นชีวะอย่างใกล้ชิด ในการศึกษาในหลอดทดลองของเราพื้นที่ที่ไม่ได้สัมผัสเหล่านี้ป้องกันการฆ่าแบคทีเรียที่ทำงานได้ภายในแผ่นฟิล์มชีวภาพ เราประเมินความมีชีวิตของแบคทีเรียหลังจากการรักษา 24 ชั่วโมงเท่านั้น เมื่อเวลาผ่านไปเมื่อการแต่งกายอิ่มตัวมากขึ้นอาจมีพื้นที่ตายน้อยลงลดพื้นที่สำหรับแบคทีเรียที่ทำงานได้เหล่านี้ อย่างไรก็ตามสิ่งนี้เน้นถึงความสำคัญขององค์ประกอบของการแต่งตัวไม่ใช่แค่ประเภทของเงินในการแต่งตัว
ในขณะที่การศึกษาในหลอดทดลองมีประโยชน์สำหรับการเปรียบเทียบประสิทธิภาพของเทคโนโลยีเงินที่แตกต่างกัน แต่ก็เป็นสิ่งสำคัญที่จะต้องเข้าใจถึงผลกระทบของการแต่งกายเหล่านี้ต่อแผ่นชีวะในวิฟซึ่งเนื้อเยื่อและการตอบสนองของภูมิคุ้มกันมีส่วนช่วยในการสร้างประสิทธิภาพของเครื่องแต่งกายต่อแผ่นชีวะ ผลของการแต่งกายเหล่านี้ต่อแผ่นชีวะแผลถูกตรวจพบโดยใช้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบสแกนและการย้อมสีอิเล็กทรอนิกส์ของแผ่นชีวะโดยใช้สีย้อมดีเอ็นเอภายในเซลล์และนอกเซลล์ เราพบว่าหลังจาก 3 วันของการรักษาเครื่องแต่งกายทั้งหมดมีประสิทธิภาพในการลด DNA ปลอดเซลล์ในบาดแผลที่ติดเชื้อฟิล์มชีวภาพ แต่การแต่งกาย AG1+ นั้นมีประสิทธิภาพน้อยกว่าในบาดแผลที่ติดเชื้อ Staphylococcus aureus กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบสแกนยังแสดงให้เห็นว่ามีแบคทีเรียน้อยลงอย่างมีนัยสำคัญในบาดแผลที่ได้รับการรักษาด้วยน้ำสลัดสีเงินแม้ว่าจะเด่นชัดกว่าด้วยการแต่งตัวเกลือ AG ออกซิเจนและการแต่งตัว AG1++ EDTA/BC เมื่อเทียบกับการแต่งตัว AG1+ ข้อมูลเหล่านี้แสดงให้เห็นว่าเครื่องแต่งกายเงินที่ผ่านการทดสอบมีผลกระทบที่แตกต่างกันไปในโครงสร้างของแผ่นฟิล์มชีวภาพ แต่ไม่มีเครื่องแต่งกายสีเงินใด ๆ ที่สามารถกำจัดแผ่นฟิล์มชีวภาพได้สนับสนุนความต้องการวิธีการแบบองค์รวมในการรักษาโรคติดเชื้อฟิล์มชีวภาพ การใช้ปลอกแขนสีเงิน การรักษานำหน้าด้วย debridement ทางกายภาพเพื่อกำจัดแผ่นฟิล์มส่วนใหญ่
บาดแผลเรื้อรังมักจะอยู่ในสถานะของการอักเสบอย่างรุนแรงโดยมีเซลล์อักเสบส่วนเกินที่เหลืออยู่ในเนื้อเยื่อแผลเป็นระยะเวลานานทำให้เกิดความเสียหายของเนื้อเยื่อและลดลงของออกซิเจนที่จำเป็นสำหรับการเผาผลาญของเซลล์ที่มีประสิทธิภาพและการทำงานในแผล 26 Biofilms ทำให้สภาพแวดล้อมที่เป็นศัตรูเป็นมิตรมากขึ้นโดยส่งผลเสียต่อการรักษาในหลากหลายวิธีรวมถึงการยับยั้งการเพิ่มจำนวนเซลล์และการย้ายถิ่นและการเปิดใช้งาน cytokines27 proinflammatory 27 เมื่อน้ำสลัดสีเงินมีประสิทธิภาพมากขึ้นจึงเป็นสิ่งสำคัญที่จะต้องเข้าใจถึงผลกระทบที่พวกเขามีต่อสภาพแวดล้อมและการรักษา
ที่น่าสนใจแม้ว่าการแต่งกายเงินทั้งหมดจะส่งผลกระทบต่อองค์ประกอบฟิล์มชีวภาพ แต่มีเพียงเครื่องแต่งกายเกลือสีเงินที่มีออกซิเจนเท่านั้นที่เพิ่มขึ้นอีกครั้งของบาดแผลที่ติดเชื้อเหล่านี้ ข้อมูลเหล่านี้สนับสนุนการค้นพบก่อนหน้าของเรา 17 และของ Kalan และคณะ (2017) 28 ซึ่งแสดงให้เห็นถึงความปลอดภัยที่ดีและโปรไฟล์ความเป็นพิษของเกลือเงินออกซิเจนเนื่องจากความเข้มข้นต่ำของเงินมีประสิทธิภาพต่อแผ่นชีวะ
การศึกษาในปัจจุบันของเราเน้นถึงความแตกต่างของเทคโนโลยีเงินระหว่างน้ำสลัดยาต้านจุลชีพและผลกระทบของเทคโนโลยีนี้ต่อสภาพแวดล้อมของแผลและการรักษาที่ไม่ขึ้นกับการติดเชื้อ อย่างไรก็ตามผลลัพธ์เหล่านี้แตกต่างจากการศึกษาก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่าการแต่งตัว AG1 + + EDTA/BC ช่วยปรับปรุงพารามิเตอร์การรักษาของหูกระต่ายที่ได้รับบาดเจ็บในร่างกาย อย่างไรก็ตามนี่อาจเป็นเพราะความแตกต่างในแบบจำลองสัตว์เวลาการวัดและวิธีการใช้งานแบคทีเรีย 29 ในกรณีนี้การวัดบาดแผลถูกใช้เวลา 12 วันหลังจากได้รับบาดเจ็บเพื่อให้ส่วนผสมที่ใช้งานของการแต่งกายดำเนินการกับแผ่นชีวะในระยะเวลานานขึ้น สิ่งนี้ได้รับการสนับสนุนจากการศึกษาที่แสดงให้เห็นว่าแผลที่ขาที่ติดเชื้อทางคลินิกได้รับการรักษาด้วย AG1 + + EDTA/BC ในขั้นต้นมีขนาดเพิ่มขึ้นหลังจากการรักษาหนึ่งสัปดาห์และในอีก 3 สัปดาห์ข้างหน้าของการรักษาด้วย AG1 + + EDTA/BC และภายใน 4 สัปดาห์ของ การใช้ยาเสพติดที่ไม่ใช่ยาเสพติด ยาเสพติด เครื่องแต่งกาย CMC เพื่อลดขนาดของแผลที่ 30
ก่อนหน้านี้รูปแบบและความเข้มข้นของเงินได้แสดงให้เห็นว่าเป็นพิษต่อเซลล์ในหลอดทดลอง 11 แต่ผลลัพธ์ในหลอดทดลองเหล่านี้ไม่ได้แปลเป็นผลข้างเคียงในร่างกายเสมอไป นอกจากนี้ความก้าวหน้าในเทคโนโลยีเงินและความเข้าใจที่ดีขึ้นเกี่ยวกับสารประกอบเงินและความเข้มข้นในการแต่งกายได้นำไปสู่การพัฒนาน้ำสลัดสีเงินที่ปลอดภัยและมีประสิทธิภาพมากมาย อย่างไรก็ตามเนื่องจากเทคโนโลยีการแต่งตัวเงินความก้าวหน้าเป็นสิ่งสำคัญที่จะต้องเข้าใจผลกระทบของการแต่งกายเหล่านี้ต่อสิ่งแวดล้อมแผล 31,32,33 ก่อนหน้านี้มีรายงานว่าอัตราการเพิ่มขึ้นของการขยายตัวอีกครั้งสอดคล้องกับสัดส่วนที่เพิ่มขึ้นของแมคโครฟาจ M2 ต้านการอักเสบที่เพิ่มขึ้นเมื่อเทียบกับฟีโนไทป์ M1 ที่อักเสบ สิ่งนี้ถูกบันทึกไว้ในรูปแบบเมาส์ก่อนหน้านี้ที่มีการเปรียบเทียบการแต่งกายด้วยแผลไฮโดรเจลสีเงินกับซัลฟาเดียซีนสีเงินและไฮโดรเจลที่ไม่ใช่แรนดิเมีย 34
บาดแผลเรื้อรังอาจมีการอักเสบมากเกินไปและพบว่าการมีอยู่ของนิวโทรฟิลส่วนเกินอาจเป็นอันตรายต่อการรักษาแผล 35 ในการศึกษาในหนูนิวโทรฟิลที่พร่องไปมาการปรากฏตัวของนิวโทรฟิลล่าช้า reepithelialization การปรากฏตัวของนิวโทรฟิลส่วนเกินนำไปสู่โปรตีเอสระดับสูงและสปีชีส์ออกซิเจนปฏิกิริยาเช่นซูเปอร์ออกไซด์และไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ซึ่งเกี่ยวข้องกับแผลเรื้อรังและการรักษาช้า 37,38 ในทำนองเดียวกันการเพิ่มขึ้นของจำนวนแมคโครฟาจหากไม่สามารถควบคุมได้สามารถนำไปสู่การรักษาบาดแผลที่ล่าช้า 39 การเพิ่มขึ้นนี้มีความสำคัญอย่างยิ่งหากแมคโครฟาจไม่สามารถเปลี่ยนจากฟีโนไทป์โปรอักเสบไปเป็นฟีโนไทป์ที่ได้รับการรักษาอย่างโปรส่งผลให้บาดแผลไม่สามารถออกจากระยะการอักเสบของการรักษา 40 เราสังเกตเห็นว่าการลดลงของนิวโทรฟิลและแมคโครฟาจในบาดแผลที่ติดเชื้อฟิล์มชีวภาพหลังจาก 3 วันของการรักษาด้วยน้ำสลัดสีเงินทั้งหมด แต่การลดลงนั้นเด่นชัดมากขึ้นด้วยน้ำสลัดออกซิเจน การลดลงนี้อาจเป็นผลโดยตรงจากการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันต่อเงินการตอบสนองต่อการลดลงของ bioburden หรือแผลอยู่ในระยะต่อมาของการรักษาและดังนั้นเซลล์ภูมิคุ้มกันในแผลจะลดลง การลดจำนวนเซลล์อักเสบในแผลอาจรักษาสภาพแวดล้อมที่เอื้อต่อการรักษาแผล กลไกของการกระทำของวิธีการที่ Ag oxysalts ส่งเสริมการรักษาที่ไม่ขึ้นกับการติดเชื้อนั้นไม่ชัดเจน แต่ความสามารถของ Ag oxysalts ในการผลิตออกซิเจนและทำลายระดับไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ที่เป็นอันตรายซึ่งเป็นสื่อกลางของการอักเสบอาจอธิบายสิ่งนี้และต้องมีการศึกษาเพิ่มเติม 17
บาดแผลที่ติดเชื้อเรื้อรังที่ไม่ได้รับการรักษาเป็นปัญหาสำหรับทั้งแพทย์และผู้ป่วย แม้ว่าการแต่งกายจำนวนมากอ้างว่ามีประสิทธิภาพของยาต้านจุลชีพ แต่การวิจัยไม่ค่อยมุ่งเน้นไปที่ปัจจัยสำคัญอื่น ๆ ที่มีอิทธิพลต่อสภาพแวดล้อมที่มีขนาดเล็ก การศึกษาครั้งนี้แสดงให้เห็นว่าเทคโนโลยีเงินที่แตกต่างกันมีประสิทธิภาพของยาต้านจุลชีพที่แตกต่างกันและที่สำคัญผลกระทบที่แตกต่างกันต่อสภาพแวดล้อมของแผลและการรักษาโดยไม่ขึ้นกับการติดเชื้อ แม้ว่าการศึกษาในหลอดทดลองและในร่างกายเหล่านี้จะแสดงให้เห็นถึงประสิทธิภาพของเครื่องแต่งกายเหล่านี้ในการรักษาโรคติดเชื้อและส่งเสริมการรักษาการทดลองแบบควบคุมแบบสุ่มจำเป็นต้องประเมินประสิทธิภาพของเครื่องแต่งกายเหล่านี้ในคลินิก
ชุดข้อมูลที่ใช้และ/หรือวิเคราะห์ในระหว่างการศึกษาปัจจุบันมีให้บริการจากผู้เขียนที่เกี่ยวข้องตามคำขอที่สมเหตุสมผล