ความหลากหลายของเส้นใยกล้ามเนื้อโครงร่างมนุษย์นอกเหนือจากสายโซ่หนักไมโอซิน

ขอบคุณที่เข้าชม nature.com เบราว์เซอร์ที่คุณใช้อยู่มีการรองรับ CSS อย่างจำกัด เพื่อประสบการณ์การใช้งานที่ดีที่สุด เราขอแนะนำให้ใช้เบราว์เซอร์เวอร์ชันล่าสุด (หรือปิดโหมดความเข้ากันได้ใน Internet Explorer) นอกจากนี้ เพื่อให้มั่นใจได้ว่าเว็บไซต์นี้จะได้รับการสนับสนุนอย่างต่อเนื่อง เว็บไซต์นี้จะไม่มีสไตล์และ JavaScript
กล้ามเนื้อโครงร่างเป็นเนื้อเยื่อที่ไม่เป็นเนื้อเดียวกัน ประกอบด้วยไมโอไฟบริลเป็นส่วนใหญ่ ซึ่งในมนุษย์มักถูกจัดประเภทเป็นสามประเภท ได้แก่ ประเภท "ช้า" (ประเภท 1) และประเภท "เร็ว" สองประเภท (ประเภท 2A และ 2X) อย่างไรก็ตาม ความแตกต่างระหว่างและภายในประเภทของไมโอไฟบริลแบบดั้งเดิมยังคงไม่เป็นที่เข้าใจอย่างถ่องแท้ เราจึงใช้วิธีการทางทรานสคริปโตมิกส์และโปรตีโอมิกส์กับไมโอไฟบริลแต่ละเส้นจำนวน 1050 และ 1038 เส้นจากกล้ามเนื้อวาสตัสลาเทอราลิสของมนุษย์ ตามลำดับ การศึกษาโปรตีโอมิกส์รวมถึงผู้ชาย และการศึกษาทรานสคริปโตมิกส์รวมถึงผู้ชาย 10 คนและผู้หญิง 2 คน นอกเหนือจากไอโซฟอร์มของไมโอซินเฮฟวีเชนแล้ว เรายังระบุโปรตีนเมตาบอลิก โปรตีนไรโบโซม และโปรตีนเชื่อมต่อเซลล์ว่าเป็นแหล่งที่มาของความแปรปรวนระหว่างไมโอไฟบริลแบบหลายมิติ ยิ่งไปกว่านั้น แม้ว่าจะมีการระบุกลุ่มของเส้นใยช้าและเร็ว ข้อมูลของเราชี้ให้เห็นว่าเส้นใยประเภท 2X นั้นไม่สามารถแยกแยะได้จากเส้นใยหดตัวเร็วอื่นๆ ในทางฟีโนไทป์ นอกจากนี้ การจำแนกประเภทตามสายโซ่หนักของไมโอซินยังไม่เพียงพอที่จะอธิบายลักษณะฟีโนไทป์ของเส้นใยกล้ามเนื้อในโรคกล้ามเนื้อเนมาไลน์ โดยรวมแล้ว ข้อมูลของเราชี้ให้เห็นถึงความหลากหลายของเส้นใยกล้ามเนื้อในหลายมิติ โดยแหล่งที่มาของความแปรปรวนนั้นขยายออกไปนอกเหนือจากไอโซฟอร์มของสายโซ่หนักของไมโอซิน
ความไม่สม่ำเสมอของเซลล์เป็นคุณลักษณะโดยธรรมชาติของระบบชีวภาพทั้งหมด ทำให้เซลล์สามารถเชี่ยวชาญเพื่อตอบสนองความต้องการที่แตกต่างกันของเนื้อเยื่อและเซลล์¹ มุมมองดั้งเดิมเกี่ยวกับความไม่สม่ำเสมอของเส้นใยกล้ามเนื้อโครงร่างคือ เซลล์ประสาทสั่งการเป็นตัวกำหนดชนิดของเส้นใยภายในหน่วยสั่งการ และชนิดของเส้นใย (เช่น ชนิดที่ 1 ชนิดที่ 2A และชนิดที่ 2X ในมนุษย์) ถูกกำหนดโดยลักษณะของไอโซฟอร์มของไมโอซินเฮฟวีเชน (MYH)² ซึ่งในตอนแรกนั้นอิงจากความไม่เสถียรของ pH ATPase^3,4 และต่อมาอิงจากการแสดงออกทางโมเลกุลของ MYH⁵ อย่างไรก็ตาม ด้วยการระบุและการยอมรับเส้นใย "ผสม" ที่แสดงออกร่วมกันของ MYH หลายชนิดในสัดส่วนที่แตกต่างกัน เส้นใยกล้ามเนื้อโครงร่างจึงถูกมองว่าเป็นความต่อเนื่องมากกว่าที่จะเป็นชนิดของเส้นใยที่แตกต่างกัน⁶ ถึงกระนั้นก็ตาม วงการนี้ยังคงพึ่งพา MYH อย่างมากในฐานะตัวจำแนกหลักสำหรับการจำแนกประเภทไมโอไฟเบอร์ ซึ่งเป็นมุมมองที่อาจได้รับอิทธิพลจากข้อจำกัดและอคติที่สำคัญของการศึกษาในสัตว์ฟันแทะในยุคแรกๆ ซึ่งมีโปรไฟล์การแสดงออกของ MYH และช่วงของชนิดเส้นใยที่แตกต่างกัน จากที่พบในมนุษย์² สถานการณ์ยิ่งซับซ้อนขึ้นไปอีกเนื่องจากกล้ามเนื้อโครงร่างของมนุษย์แต่ละส่วนมีเส้นใยกล้ามเนื้อหลากหลายประเภท⁷ กล้ามเนื้อวาสตัส ลาเทอราลิสเป็นกล้ามเนื้อผสมที่มีโปรไฟล์การแสดงออกของ MYH อยู่ในระดับกลาง (และจึงเป็นตัวแทน)⁷ ยิ่งไปกว่านั้น ความง่ายในการเก็บตัวอย่างทำให้กล้ามเนื้อนี้เป็นกล้ามเนื้อที่ได้รับการศึกษามากที่สุดในมนุษย์
ดังนั้น การตรวจสอบความหลากหลายของเส้นใยกล้ามเนื้อโครงร่างอย่างเป็นกลางโดยใช้เครื่องมือ “โอมิกส์” ที่ทรงพลังจึงมีความสำคัญอย่างยิ่ง แต่ก็เป็นเรื่องที่ท้าทายเช่นกัน ส่วนหนึ่งเป็นเพราะลักษณะที่มีนิวเคลียสหลายอันของเส้นใยกล้ามเนื้อโครงร่าง อย่างไรก็ตาม เทคโนโลยีทรานสคริปโตมิกส์8,9 และโปรตีโอมิกส์10 ได้มีการปฏิวัติในด้านความไวในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมาเนื่องจากความก้าวหน้าทางเทคโนโลยีต่างๆ ทำให้สามารถวิเคราะห์กล้ามเนื้อโครงร่างได้ที่ความละเอียดระดับเส้นใยเดี่ยว ส่งผลให้มีความก้าวหน้าอย่างมากในการระบุลักษณะความหลากหลายของเส้นใยเดี่ยวและการตอบสนองต่อสิ่งกระตุ้นที่ทำให้เกิดการฝ่อและการแก่ชรา11,12,13,14,15,16,17,18 ที่สำคัญ ความก้าวหน้าทางเทคโนโลยีเหล่านี้มีการประยุกต์ใช้ทางคลินิก ทำให้สามารถระบุลักษณะการทำงานที่ผิดปกติที่เกี่ยวข้องกับโรคได้อย่างละเอียดและแม่นยำยิ่งขึ้น ตัวอย่างเช่น พยาธิสรีรวิทยาของโรคกล้ามเนื้ออ่อนแรงชนิดเนมาไลน์ ซึ่งเป็นหนึ่งในโรคกล้ามเนื้อที่ถ่ายทอดทางพันธุกรรมที่พบบ่อยที่สุด (MIM 605355 และ MIM 161800) นั้นซับซ้อนและเข้าใจยาก^19,20 ดังนั้น การระบุลักษณะการทำงานที่ผิดปกติของเส้นใยกล้ามเนื้อโครงร่างให้ดียิ่งขึ้น อาจนำไปสู่ความก้าวหน้าอย่างมากในการทำความเข้าใจโรคนี้
เราได้พัฒนาวิธีการวิเคราะห์ทรานสคริปโตมิกและโปรตีโอมิกของเส้นใยกล้ามเนื้อโครงร่างเดี่ยวที่แยกได้ด้วยมือจากตัวอย่างชิ้นเนื้อของมนุษย์ และนำไปประยุกต์ใช้กับเส้นใยหลายพันเส้น ทำให้เราสามารถตรวจสอบความแตกต่างทางเซลล์ของเส้นใยกล้ามเนื้อโครงร่างของมนุษย์ได้ ในระหว่างการทำงานนี้ เราได้แสดงให้เห็นถึงศักยภาพของการจำแนกฟีโนไทป์ของเส้นใยกล้ามเนื้อด้วยทรานสคริปโตมิกและโปรตีโอมิก และระบุโปรตีนเมตาบอลิก โปรตีนไรโบโซม และโปรตีนเชื่อมต่อเซลล์ว่าเป็นแหล่งสำคัญของความแปรปรวนระหว่างเส้นใย นอกจากนี้ การใช้กระบวนการทำงานด้านโปรตีโอมิกนี้ เราได้ระบุความสำคัญทางคลินิกของโรคกล้ามเนื้อที่เกิดจากพยาธิไส้เดือนฝอยในเส้นใยกล้ามเนื้อโครงร่างเดี่ยว โดยเผยให้เห็นการเปลี่ยนแปลงที่ประสานกันไปสู่เส้นใยที่ไม่ใช้ออกซิเจนโดยไม่ขึ้นอยู่กับชนิดของเส้นใยตาม MYH
เพื่อตรวจสอบความแตกต่างของเส้นใยกล้ามเนื้อโครงร่างของมนุษย์ เราได้พัฒนากระบวนการทำงานสองแบบเพื่อให้สามารถวิเคราะห์ทรานสคริปโตมและโปรตีโอเมของเส้นใยกล้ามเนื้อโครงร่างแต่ละเส้นได้ (รูปที่ 1A และรูปประกอบเพิ่มเติม 1A) เราได้พัฒนาและปรับปรุงขั้นตอนวิธีการหลายขั้นตอน ตั้งแต่การจัดเก็บตัวอย่างและการรักษาความสมบูรณ์ของ RNA และโปรตีน ไปจนถึงการเพิ่มประสิทธิภาพปริมาณงานสำหรับแต่ละวิธี สำหรับการวิเคราะห์ทรานสคริปโตมนั้น ทำได้โดยการใส่บาร์โค้ดโมเลกุลเฉพาะตัวอย่างในขั้นตอนเริ่มต้นของการถอดรหัสย้อนกลับ ทำให้สามารถรวมเส้นใย 96 เส้นเข้าด้วยกันเพื่อการประมวลผลขั้นต่อไปอย่างมีประสิทธิภาพ การจัดลำดับที่ลึกกว่า (±1 ล้านอ่านต่อเส้นใย) เมื่อเทียบกับวิธีการเซลล์เดี่ยวแบบดั้งเดิม ช่วยเพิ่มข้อมูลทรานสคริปโตมให้สมบูรณ์ยิ่งขึ้น 21 สำหรับโปรตีโอมิกส์ เราใช้การไล่ระดับโครมาโทกราฟีแบบสั้น (21 นาที) ร่วมกับการเก็บข้อมูล DIA-PASEF บนเครื่องแมสสเปกโทรเมตรี timsTOF เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพความลึกของโปรตีโอมในขณะที่ยังคงรักษาปริมาณงานสูง 22,23 เพื่อตรวจสอบความแตกต่างของเส้นใยกล้ามเนื้อโครงร่างที่แข็งแรง เราได้ทำการวิเคราะห์ทรานสคริปโตมของเส้นใยแต่ละเส้นจำนวน 1,050 เส้นจากผู้บริจาคที่เป็นผู้ใหญ่ที่มีสุขภาพดี 14 คน และโปรตีโอมของเส้นใยจำนวน 1,038 เส้นจากผู้บริจาคที่เป็นผู้ใหญ่ที่มีสุขภาพดี 5 คน (ตารางเสริม 1) ในบทความนี้ ชุดข้อมูลเหล่านี้จะถูกเรียกว่าทรานสคริปโตมและโปรตีโอมของเส้นใย 1,000 เส้น ตามลำดับ วิธีการของเราตรวจพบทรานสคริปต์ทั้งหมด 27,237 รายการและโปรตีน 2,983 รายการในการวิเคราะห์ทรานสคริปโตมและโปรตีโอมของเส้นใย 1,000 เส้น (รูปที่ 1A ชุดข้อมูลเสริม 1–2) หลังจากกรองชุดข้อมูลทรานสคริปโตมและโปรตีโอมสำหรับยีนที่ตรวจพบมากกว่า 1,000 ยีนและค่าที่ถูกต้อง 50% ต่อเส้นใยแล้ว การวิเคราะห์ทางชีวสารสนเทศศาสตร์ต่อมาได้ดำเนินการกับเส้นใย 925 และ 974 เส้นในทรานสคริปโตมและโปรตีโอม ตามลำดับ หลังจากทำการกรองแล้ว ตรวจพบยีนโดยเฉลี่ย 4257 ± 1557 ยีน และโปรตีน 2015 ± 234 โปรตีน (ค่าเฉลี่ย ± ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน) ต่อเส้นใย โดยมีความแปรปรวนระหว่างบุคคลจำกัด (ภาพประกอบเพิ่มเติม 1B–C, ชุดข้อมูลเพิ่มเติม 3–4) อย่างไรก็ตาม ความแปรปรวนภายในบุคคลนั้นเด่นชัดกว่าในผู้เข้าร่วมการวิจัย ซึ่งอาจเป็นเพราะความแตกต่างของปริมาณ RNA/โปรตีนระหว่างเส้นใยที่มีความยาวและพื้นที่หน้าตัดต่างกัน สำหรับโปรตีนส่วนใหญ่ (>2000) ค่าสัมประสิทธิ์ความแปรปรวนต่ำกว่า 20% (ภาพประกอบเพิ่มเติม 1D) ทั้งสองวิธีช่วยให้สามารถตรวจจับทรานสคริปต์และโปรตีนที่มีช่วงไดนามิกกว้าง พร้อมด้วยลายเซ็นการแสดงออกสูงที่สำคัญต่อการหดตัวของกล้ามเนื้อ (เช่น ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) (ภาพประกอบเพิ่มเติม 1E–F) คุณลักษณะส่วนใหญ่ที่ระบุได้นั้นพบได้ทั่วไปในชุดข้อมูลทรานสคริปโตมิกและโปรตีโอมิก (ภาพประกอบเพิ่มเติม 1G) และค่าความเข้มเฉลี่ยของ UMI/LFQ ของคุณลักษณะเหล่านี้มีความสัมพันธ์กันค่อนข้างดี (r = 0.52) (ภาพประกอบเพิ่มเติม 1H)
ขั้นตอนการทำงานของทรานสคริปโตมิกส์และโปรตีโอมิกส์ (สร้างด้วย BioRender.com) BD เส้นโค้งช่วงไดนามิกสำหรับ MYH7, MYH2 และ MYH1 และค่าเกณฑ์ที่คำนวณได้สำหรับการกำหนดประเภทเส้นใย E, F การกระจายตัวของการแสดงออกของ MYH ในเส้นใยต่างๆ ในชุดข้อมูลทรานสคริปโตมิกส์และโปรตีโอมิกส์ G, H แผนภาพ Uniform Diversity Approximation and Projection (UMAP) สำหรับทรานสคริปโตมิกส์และโปรตีโอมิกส์ที่ระบายสีตามประเภทเส้นใยตาม MYH I, J แผนภาพคุณลักษณะที่แสดงการแสดงออกของ MYH7, MYH2 และ MYH1 ในชุดข้อมูลทรานสคริปโตมิกส์และโปรตีโอมิกส์
ในขั้นต้น เราตั้งเป้าที่จะกำหนดประเภทเส้นใยตาม MYH ให้กับเส้นใยแต่ละเส้นโดยใช้วิธีการที่เหมาะสมที่สุด ซึ่งใช้ประโยชน์จากความไวสูงและช่วงไดนามิกของการแสดงออกของ MYH ในชุดข้อมูลโอไมซ์ การศึกษาครั้งก่อนๆ ใช้เกณฑ์ที่กำหนดขึ้นเองเพื่อติดฉลากเส้นใยว่าเป็นประเภท 1 บริสุทธิ์ ประเภท 2A ประเภท 2X หรือแบบผสม โดยอิงจากเปอร์เซ็นต์การแสดงออกคงที่ของ MYH ต่างๆ11,14,24 เราใช้วิธีการที่แตกต่างออกไป โดยจัดอันดับการแสดงออกของเส้นใยแต่ละเส้นตาม MYH ที่เราใช้ในการกำหนดประเภทเส้นใย ได้แก่ MYH7, MYH2 และ MYH1 ซึ่งสอดคล้องกับเส้นใยประเภท 1 ประเภท 2A และประเภท 2X ตามลำดับ จากนั้นเราคำนวณจุดเปลี่ยนต่ำสุดของเส้นโค้งแต่ละเส้นทางคณิตศาสตร์ และใช้เป็นเกณฑ์ในการกำหนดเส้นใยว่าเป็นบวก (เหนือเกณฑ์) หรือลบ (ต่ำกว่าเกณฑ์) สำหรับ MYH แต่ละชนิด (รูปที่ 1B–D) ข้อมูลเหล่านี้แสดงให้เห็นว่า MYH7 (รูปที่ 1B) และ MYH2 (รูปที่ 1C) มีรูปแบบการแสดงออกแบบเปิด/ปิดที่ชัดเจนกว่าในระดับ RNA เมื่อเทียบกับระดับโปรตีน ที่จริงแล้ว ในระดับโปรตีน มีเส้นใยเพียงไม่กี่เส้นที่ไม่แสดงออก MYH7 และไม่มีเส้นใยใดที่มีการแสดงออกของ MYH2 100% ต่อไป เราใช้เกณฑ์การแสดงออกที่กำหนดไว้ล่วงหน้าเพื่อกำหนดประเภทเส้นใยตาม MYH ให้กับเส้นใยทั้งหมดในแต่ละชุดข้อมูล ตัวอย่างเช่น เส้นใย MYH7+/MYH2-/MYH1- ถูกกำหนดให้เป็นประเภทที่ 1 ในขณะที่เส้นใย MYH7-/MYH2+/MYH1+ ถูกกำหนดให้เป็นประเภทผสม 2A/2X (ดูตารางเสริม 2 สำหรับคำอธิบายฉบับเต็ม) เมื่อรวมเส้นใยทั้งหมด เราสังเกตเห็นการกระจายตัวของประเภทเส้นใยตาม MYH ที่คล้ายคลึงกันอย่างน่าทึ่งทั้งในระดับ RNA (รูปที่ 1E) และระดับโปรตีน (รูปที่ 1F) ในขณะที่องค์ประกอบสัมพัทธ์ของประเภทเส้นใยตาม MYH แตกต่างกันไปในแต่ละบุคคล ดังที่คาดไว้ (รูปเสริม 2A) เส้นใยส่วนใหญ่ถูกจัดประเภทเป็นชนิดที่ 1 บริสุทธิ์ (34–35%) หรือชนิดที่ 2A (36–38%) แม้ว่าจะตรวจพบเส้นใยชนิดผสม 2A/2X จำนวนมากเช่นกัน (16–19%) ความแตกต่างที่เห็นได้ชัดคือ เส้นใยชนิดที่ 2X บริสุทธิ์สามารถตรวจพบได้เฉพาะในระดับ RNA เท่านั้น แต่ไม่สามารถตรวจพบได้ในระดับโปรตีน ซึ่งบ่งชี้ว่าการแสดงออกของ MYH อย่างรวดเร็วนั้นถูกควบคุมอย่างน้อยบางส่วนหลังการถอดรหัส
เราได้ตรวจสอบความถูกต้องของวิธีการจำแนกประเภทเส้นใย MYH โดยใช้โปรตีโอมิกส์ด้วยวิธีดอตบลอตติ้งแบบใช้แอนติบอดี และทั้งสองวิธีให้ผลลัพธ์ที่สอดคล้องกัน 100% ในการระบุเส้นใยประเภท 1 และประเภท 2A ที่บริสุทธิ์ (ดูภาพประกอบเพิ่มเติม 2B) อย่างไรก็ตาม วิธีการที่ใช้โปรตีโอมิกส์มีความไวมากกว่า มีประสิทธิภาพมากกว่าในการระบุเส้นใยผสม และสามารถวัดสัดส่วนของยีน MYH แต่ละตัวในแต่ละเส้นใยได้ ข้อมูลเหล่านี้แสดงให้เห็นถึงประสิทธิภาพของการใช้วิธีการทางโอไมกส์ที่มีความเที่ยงตรงและมีความไวสูงในการจำแนกประเภทเส้นใยกล้ามเนื้อโครงร่าง
จากนั้น เราใช้ข้อมูลที่ได้จากการวิเคราะห์ทรานสคริปโตมิกส์และโปรตีโอมิกส์มารวมกันเพื่อจำแนกเส้นใยกล้ามเนื้ออย่างเป็นกลางโดยพิจารณาจากทรานสคริปโตมหรือโปรตีโอมทั้งหมด โดยใช้วิธีการประมาณค่าและการฉายภาพแบบเอกรูป (UMAP) เพื่อลดมิติให้เหลือหกองค์ประกอบหลัก (ภาพประกอบเพิ่มเติม 3A–B) เราจึงสามารถแสดงภาพความแปรปรวนของเส้นใยกล้ามเนื้อในทรานสคริปโตม (รูปที่ 1G) และโปรตีโอม (รูปที่ 1H) ได้ ที่น่าสังเกตคือ เส้นใยกล้ามเนื้อไม่ได้ถูกจัดกลุ่มตามผู้เข้าร่วม (ภาพประกอบเพิ่มเติม 3C–D) หรือวันทดสอบ (ภาพประกอบเพิ่มเติม 3E) ในชุดข้อมูลทรานสคริปโตมิกส์หรือโปรตีโอมิกส์ ซึ่งบ่งชี้ว่าความแปรปรวนภายในบุคคลในเส้นใยกล้ามเนื้อโครงร่างนั้นสูงกว่าความแปรปรวนระหว่างบุคคล ในแผนภาพ UMAP ปรากฏกลุ่มที่แตกต่างกันสองกลุ่มซึ่งแสดงถึงเส้นใยกล้ามเนื้อ "เร็ว" และ "ช้า" (รูปที่ 1G–H) เส้นใยกล้ามเนื้อ MYH7+ (ชนิดช้า) กระจุกตัวอยู่ที่ขั้วบวกของ UMAP1 ในขณะที่เส้นใยกล้ามเนื้อ MYH2+ และ MYH1+ (ชนิดเร็ว) กระจุกตัวอยู่ที่ขั้วลบของ UMAP1 (ภาพที่ 1I–J) อย่างไรก็ตาม ไม่มีการแยกแยะความแตกต่างระหว่างชนิดของเส้นใยกล้ามเนื้อชนิดเร็ว (เช่น ชนิด 2A, ชนิด 2X หรือชนิดผสม 2A/2X) โดยอาศัยการแสดงออกของ MYH ซึ่งบ่งชี้ว่าการแสดงออกของ MYH1 (ภาพที่ 1I–J) หรือเครื่องหมายเส้นใยกล้ามเนื้อ 2X แบบคลาสสิกอื่นๆ เช่น ACTN3 หรือ MYLK2 (ภาพเสริม 4A–B) ไม่สามารถแยกแยะความแตกต่างระหว่างชนิดของเส้นใยกล้ามเนื้อได้เมื่อพิจารณาจากทรานสคริปโตมหรือโปรตีโอมทั้งหมด นอกจากนี้ เมื่อเปรียบเทียบกับ MYH2 และ MYH7 พบว่ามีทรานสคริปต์หรือโปรตีนเพียงไม่กี่ชนิดที่มีความสัมพันธ์เชิงบวกกับ MYH1 (ภาพเสริม 4C–H) ซึ่งบ่งชี้ว่าปริมาณของ MYH1 ไม่ได้สะท้อนถึงทรานสคริปโตม/โปรตีโอมของเส้นใยกล้ามเนื้ออย่างสมบูรณ์ ได้ข้อสรุปที่คล้ายคลึงกันเมื่อประเมินการแสดงออกผสมของไอโซฟอร์ม MYH ทั้งสามชนิดในระดับ UMAP (ภาพประกอบเพิ่มเติม 4I–J) ดังนั้น ในขณะที่สามารถระบุเส้นใย 2X ได้ในระดับทรานสคริปต์โดยอาศัยการวัดปริมาณ MYH เพียงอย่างเดียว แต่เส้นใย MYH1+ นั้นไม่สามารถแยกแยะออกจากเส้นใยเร็วชนิดอื่นได้เมื่อพิจารณาจากทรานสคริปโตมหรือโปรตีโอมทั้งหมด
เพื่อเป็นการสำรวจเบื้องต้นถึงความหลากหลายของเส้นใยกล้ามเนื้อช้าที่นอกเหนือจาก MYH เราได้ประเมินโปรตีนเฉพาะชนิดของเส้นใยกล้ามเนื้อช้าที่ได้รับการยอมรับแล้ว 4 ชนิด ได้แก่ TPM3, TNNT1, MYL3 และ ATP2A22 เส้นใยกล้ามเนื้อช้าชนิดย่อยแสดงความสัมพันธ์แบบเพียร์สันสูง แม้จะไม่สมบูรณ์แบบ กับ MYH7 ทั้งในด้านทรานสคริปโตมิกส์ (ภาพประกอบเพิ่มเติม 5A) และโปรตีโอมิกส์ (ภาพประกอบเพิ่มเติม 5B) ประมาณ 25% และ 33% ของเส้นใยกล้ามเนื้อช้าไม่ได้ถูกจัดประเภทเป็นเส้นใยกล้ามเนื้อช้าบริสุทธิ์โดยยีน/โปรตีนชนิดย่อยทั้งหมดในด้านทรานสคริปโตมิกส์ (ภาพประกอบเพิ่มเติม 5C) และโปรตีโอมิกส์ (ภาพประกอบเพิ่มเติม 5D) ตามลำดับ ดังนั้น การจำแนกประเภทเส้นใยกล้ามเนื้อช้าโดยอาศัยยีน/โปรตีนชนิดย่อยหลายชนิดจึงเพิ่มความซับซ้อน แม้แต่สำหรับโปรตีนที่ทราบกันว่าเป็นโปรตีนเฉพาะชนิดของเส้นใย สิ่งนี้ชี้ให้เห็นว่าการจำแนกประเภทเส้นใยโดยอาศัยไอโซฟอร์มของยีน/โปรตีนตระกูลเดียวอาจไม่สะท้อนถึงความหลากหลายที่แท้จริงของเส้นใยกล้ามเนื้อโครงร่างได้อย่างเพียงพอ
เพื่อสำรวจความแปรปรวนทางฟีโนไทป์ของเส้นใยกล้ามเนื้อโครงร่างมนุษย์ในระดับของแบบจำลองโอไมซ์ทั้งหมดเพิ่มเติม เราได้ทำการลดมิติข้อมูลแบบไม่ลำเอียงโดยใช้การวิเคราะห์องค์ประกอบหลัก (PCA) (รูปที่ 2A) เช่นเดียวกับแผนภาพ UMAP ทั้งผู้เข้าร่วมและวันทดสอบไม่มีอิทธิพลต่อการจัดกลุ่มเส้นใยในระดับ PCA (รูปภาพเสริม 6A–C) ในชุดข้อมูลทั้งสองชุด ประเภทของเส้นใยตาม MYH ถูกอธิบายโดย PC2 ซึ่งแสดงให้เห็นกลุ่มของเส้นใยชนิดหดตัวช้าประเภท 1 และกลุ่มที่สองซึ่งประกอบด้วยเส้นใยชนิดหดตัวเร็วประเภท 2A ประเภท 2X และเส้นใยผสม 2A/2X (รูปที่ 2A) ในชุดข้อมูลทั้งสองชุด กลุ่มทั้งสองนี้เชื่อมต่อกันด้วยเส้นใยผสมประเภท 1/2A จำนวนเล็กน้อย ตามที่คาดไว้ การวิเคราะห์การแสดงผลเกินของตัวขับเคลื่อน PC หลักยืนยันว่า PC2 ถูกขับเคลื่อนโดยลักษณะการหดตัวและการเผาผลาญ (รูปที่ 2B และรูปภาพเสริม 6D–E ชุดข้อมูลเสริม 5–6) โดยรวมแล้ว พบว่าประเภทไฟเบอร์ที่อิงตาม MYH นั้นเพียงพอที่จะอธิบายความแปรผันต่อเนื่องตาม PC2 ได้ ยกเว้นไฟเบอร์ที่เรียกว่า 2X ซึ่งกระจายอยู่ทั่วทรานสคริปโตมภายในคลัสเตอร์ที่รวดเร็ว
A. แผนภาพการวิเคราะห์องค์ประกอบหลัก (PCA) ของชุดข้อมูลทรานสคริปโตมและโปรตีโอม โดยระบายสีตามประเภทของเส้นใยตาม MYH B. การวิเคราะห์การเสริมความเข้มข้นของตัวขับเคลื่อนทรานสคริปต์และโปรตีนใน PC2 และ PC1 การวิเคราะห์ทางสถิติทำโดยใช้แพ็กเกจ clusterProfiler และค่า p ที่ปรับด้วย Benjamini-Hochberg C, D. แผนภาพ PCA ที่ระบายสีตามคำศัพท์ทางชีววิทยาของยีนการยึดเกาะระหว่างเซลล์ (GO) ในทรานสคริปโตมและคำศัพท์ GO ของคอสตาเมียร์ในโปรตีโอม ลูกศรแสดงถึงตัวขับเคลื่อนทรานสคริปต์และโปรตีนและทิศทางของพวกมัน E, F. แผนภาพคุณลักษณะการประมาณและการฉายภาพแบบเอกรูป (UMAP) ของคุณลักษณะที่เกี่ยวข้องทางคลินิกที่แสดงการไล่ระดับการแสดงออกโดยไม่ขึ้นกับประเภทของเส้นใยช้า/เร็ว G, H. ความสัมพันธ์ระหว่างตัวขับเคลื่อน PC2 และ PC1 ในทรานสคริปโตมและโปรตีโอม
โดยไม่คาดคิด ประเภทของเส้นใยกล้ามเนื้อที่อิงตาม MYH อธิบายความแปรปรวนได้สูงสุดเป็นอันดับสองเท่านั้น (PC2) ซึ่งบ่งชี้ว่าปัจจัยทางชีวภาพอื่นๆ ที่ไม่เกี่ยวข้องกับประเภทของเส้นใยกล้ามเนื้อที่อิงตาม MYH (PC1) มีบทบาทสำคัญในการควบคุมความแตกต่างของเส้นใยกล้ามเนื้อโครงร่าง การวิเคราะห์การแสดงออกเกินจริงของตัวขับเคลื่อนหลักใน PC1 เผยให้เห็นว่าความแปรปรวนใน PC1 นั้นถูกกำหนดโดยหลักๆ จากการยึดเกาะระหว่างเซลล์และปริมาณของไรโบโซมในทรานสคริปโตม และคอสตาเมียร์และโปรตีนไรโบโซมในโปรตีโอม (รูปที่ 2B และรูปภาพเสริม 6D–E ชุดข้อมูลเสริม 7) ในกล้ามเนื้อโครงร่าง คอสตาเมียร์เชื่อมต่อแผ่น Z กับซาร์โคเลมมาและมีส่วนเกี่ยวข้องกับการส่งผ่านแรงและการส่งสัญญาณ แผนภาพ PCA ที่มีคำอธิบายประกอบจำนวน 25 ภาพ โดยใช้คุณลักษณะการยึดเกาะระหว่างเซลล์ (ทรานสคริปโตม รูปที่ 2C) และคอสตาเมียร์ (โปรตีโอม รูปที่ 2D) เผยให้เห็นการเลื่อนไปทางซ้ายอย่างชัดเจนใน PC1 ซึ่งบ่งชี้ว่าคุณลักษณะเหล่านี้มีความเข้มข้นในเส้นใยบางชนิด
การตรวจสอบการจัดกลุ่มของเส้นใยกล้ามเนื้อในระดับ UMAP อย่างละเอียดมากขึ้น พบว่าคุณลักษณะส่วนใหญ่แสดงให้เห็นถึงการไล่ระดับการแสดงออกตาม MYH ที่ไม่ขึ้นกับชนิดของเส้นใยกล้ามเนื้อ มากกว่าที่จะจำเพาะเจาะจงกับกลุ่มย่อยของเส้นใยกล้ามเนื้อ ความต่อเนื่องนี้พบได้ในยีนหลายตัวที่เกี่ยวข้องกับสภาวะทางพยาธิวิทยา (รูปที่ 2E) เช่น CHCHD10 (โรคระบบประสาทและกล้ามเนื้อ), SLIT3 (กล้ามเนื้อลีบ), CTDNEP1 (โรคกล้ามเนื้อ) ความต่อเนื่องนี้ยังพบได้ในโปรตีนทั้งหมด รวมถึงโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับความผิดปกติทางระบบประสาท (UGDH), การส่งสัญญาณอินซูลิน (PHIP) และการถอดรหัส (HIST1H2AB) (รูปที่ 2F) โดยรวมแล้ว ข้อมูลเหล่านี้บ่งชี้ถึงความต่อเนื่องในความแตกต่างของการหดตัวช้า/เร็วที่ไม่ขึ้นกับชนิดของเส้นใยกล้ามเนื้อในเส้นใยกล้ามเนื้อที่แตกต่างกัน
ที่น่าสนใจคือ ยีนขับเคลื่อนใน PC2 แสดงความสัมพันธ์ที่ดีระหว่างทรานสคริปโตมและโปรตีโอม (r = 0.663) (รูปที่ 2G) ซึ่งบ่งชี้ว่าชนิดของเส้นใยกล้ามเนื้อแบบหดตัวช้าและเร็ว และโดยเฉพาะอย่างยิ่งคุณสมบัติการหดตัวและการเผาผลาญของเส้นใยกล้ามเนื้อโครงร่างนั้น ถูกควบคุมโดยการถอดรหัส อย่างไรก็ตาม ยีนขับเคลื่อนใน PC1 ไม่แสดงความสัมพันธ์ระหว่างทรานสคริปโตมและโปรตีโอม (r = -0.027) (รูปที่ 2H) ซึ่งบ่งชี้ว่าความแปรผันที่ไม่เกี่ยวข้องกับชนิดของเส้นใยกล้ามเนื้อแบบหดตัวช้า/เร็ว ส่วนใหญ่ถูกควบคุมหลังการถอดรหัส เนื่องจากความแปรผันใน PC1 ส่วนใหญ่ได้รับการอธิบายโดยคำศัพท์ทางชีววิทยาของยีนไรโบโซม และเนื่องจากไรโบโซมมีบทบาทสำคัญและเฉพาะเจาะจงในเซลล์โดยการมีส่วนร่วมและมีอิทธิพลต่อการแปลโปรตีนอย่างแข็งขัน31 เราจึงเริ่มทำการตรวจสอบความแตกต่างของไรโบโซมที่ไม่คาดคิดนี้ต่อไป
เราเริ่มต้นด้วยการระบายสีแผนภาพการวิเคราะห์องค์ประกอบหลักของโปรตีโอมิกส์ตามความอุดมสมบูรณ์สัมพัทธ์ของโปรตีนในคำศัพท์ GOCC “ไรโบโซมในไซโตพลาสซึม” (รูปที่ 3A) แม้ว่าคำศัพท์นี้จะมีความเข้มข้นสูงในด้านบวกของ PC1 ส่งผลให้เกิดการไล่ระดับเล็กน้อย แต่โปรตีนไรโบโซมเป็นตัวขับเคลื่อนการแบ่งส่วนในทั้งสองทิศทางของ PC1 (รูปที่ 3A) โปรตีนไรโบโซมที่มีความเข้มข้นสูงในด้านลบของ PC1 ได้แก่ RPL18, RPS18 และ RPS13 (รูปที่ 3B) ในขณะที่ RPL31, RPL35 และ RPL38 (รูปที่ 3C) เป็นตัวขับเคลื่อนหลักในด้านบวกของ PC1 ที่น่าสนใจคือ RPL38 และ RPS13 มีการแสดงออกสูงในกล้ามเนื้อโครงร่างเมื่อเทียบกับเนื้อเยื่ออื่นๆ (รูปภาพเสริม 7A) ไม่พบสัญญาณไรโบโซมที่โดดเด่นเหล่านี้ใน PC1 ในทรานสคริปโตม (รูปภาพเสริม 7B) ซึ่งบ่งชี้ถึงการควบคุมหลังการถอดรหัส
A. แผนภาพการวิเคราะห์องค์ประกอบหลัก (PCA) ที่ระบายสีตามคำศัพท์ทางชีววิทยาของยีนไรโบโซมในไซโตพลาสซึมทั่วทั้งโปรตีโอม ลูกศรแสดงทิศทางของการเปลี่ยนแปลงที่เกิดจากโปรตีนในแผนภาพ PCA ความยาวของเส้นสอดคล้องกับคะแนนองค์ประกอบหลักสำหรับโปรตีนที่กำหนด B, C. แผนภาพคุณลักษณะ PCA สำหรับ RPS13 และ RPL38 D. การวิเคราะห์การจัดกลุ่มแบบลำดับชั้นโดยไม่ใช้การกำกับดูแลของโปรตีนไรโบโซมในไซโตพลาสซึม E. แบบจำลองโครงสร้างของไรโบโซม 80S (PDB: 4V6X) ที่เน้นโปรตีนไรโบโซมที่มีความอุดมสมบูรณ์แตกต่างกันในเส้นใยกล้ามเนื้อโครงร่าง F. โปรตีนไรโบโซมที่มีสัดส่วนแตกต่างกันซึ่งอยู่ใกล้กับช่องทางออกของ mRNA
แนวคิดเรื่องความแตกต่างและความเชี่ยวชาญของไรโบโซมได้รับการเสนอไว้ก่อนหน้านี้แล้ว โดยการมีอยู่ของประชากรย่อยของไรโบโซมที่แตกต่างกัน (ความแตกต่างของไรโบโซม) สามารถส่งผลโดยตรงต่อการแปลโปรตีนในเนื้อเยื่อต่างๆ32 และเซลล์33 ผ่านการแปลแบบเลือกของกลุ่ม mRNA ที่เฉพาะเจาะจง34 (ความเชี่ยวชาญของไรโบโซม) เพื่อระบุประชากรย่อยของโปรตีนไรโบโซมที่แสดงออกร่วมกันในเส้นใยกล้ามเนื้อโครงร่าง เราได้ทำการวิเคราะห์การจัดกลุ่มแบบลำดับชั้นที่ไม่ต้องมีการกำกับดูแลของโปรตีนไรโบโซมในโปรตีโอม (รูปที่ 3D ชุดข้อมูลเสริม 8) ตามที่คาดไว้ โปรตีนไรโบโซมไม่ได้จัดกลุ่มตามประเภทของเส้นใยโดยอิงจาก MYH อย่างไรก็ตาม เราได้ระบุกลุ่มโปรตีนไรโบโซมที่แตกต่างกันสามกลุ่ม กลุ่มแรก (ribosomal_cluster_1) ถูกควบคุมร่วมกับ RPL38 และดังนั้นจึงมีการแสดงออกเพิ่มขึ้นในเส้นใยที่มีโปรไฟล์ PC1 เป็นบวก กลุ่มที่สอง (ribosomal_cluster_2) ถูกควบคุมร่วมกับ RPS13 และมีระดับสูงขึ้นในเส้นใยที่มีโปรไฟล์ PC1 เป็นลบ กลุ่มที่สาม (ribosomal_cluster_3) ไม่แสดงการแสดงออกที่แตกต่างกันอย่างเป็นระบบในเส้นใยกล้ามเนื้อโครงร่าง และสามารถพิจารณาได้ว่าเป็นโปรตีนไรโบโซม "หลัก" ของกล้ามเนื้อโครงร่าง ทั้งกลุ่มไรโบโซม 1 และ 2 ประกอบด้วยโปรตีนไรโบโซมที่เคยแสดงให้เห็นแล้วว่าควบคุมการแปลทางเลือก (เช่น RPL10A, RPL38, RPS19 และ RPS25) และมีอิทธิพลต่อการพัฒนาในเชิงหน้าที่ (เช่น RPL10A, RPL38)34,35,36,37,38 สอดคล้องกับผลลัพธ์ PCA การแสดงออกที่ไม่เป็นเนื้อเดียวกันของโปรตีนไรโบโซมเหล่านี้ในเส้นใยต่างๆ ยังแสดงให้เห็นถึงความต่อเนื่อง (ภาพประกอบเพิ่มเติม 7C)
เพื่อแสดงภาพตำแหน่งของโปรตีนไรโบโซมที่ไม่เหมือนกันภายในไรโบโซม เราใช้แบบจำลองโครงสร้างของไรโบโซม 80S ของมนุษย์ (Protein Data Bank: 4V6X) (รูปที่ 3E) หลังจากแยกโปรตีนไรโบโซมที่อยู่ในกลุ่มไรโบโซมต่างๆ แล้ว ตำแหน่งของพวกมันไม่ได้เรียงตัวกันอย่างใกล้ชิด ซึ่งบ่งชี้ว่าวิธีการของเราล้มเหลวในการเพิ่มความเข้มข้นของบางบริเวณ/ส่วนของไรโบโซม อย่างไรก็ตาม ที่น่าสนใจคือ สัดส่วนของโปรตีนหน่วยย่อยขนาดใหญ่ในกลุ่มที่ 2 ต่ำกว่าในกลุ่มที่ 1 และ 3 (รูปภาพเสริม 7D) เราสังเกตว่าโปรตีนที่มีสัดส่วนที่เปลี่ยนแปลงไปในเส้นใยกล้ามเนื้อโครงร่างส่วนใหญ่จะอยู่บริเวณพื้นผิวของไรโบโซม (รูปที่ 3E) ซึ่งสอดคล้องกับความสามารถในการโต้ตอบกับองค์ประกอบของตำแหน่งเข้าสู่ไรโบโซมภายใน (IRES) ในประชากร mRNA ที่แตกต่างกัน จึงช่วยประสานการแปลแบบเลือกสรร 40, 41 ยิ่งไปกว่านั้น โปรตีนจำนวนมากที่มีสัดส่วนโมลที่เปลี่ยนแปลงไปในเส้นใยกล้ามเนื้อโครงร่างนั้นตั้งอยู่ใกล้กับบริเวณการทำงาน เช่น อุโมงค์ทางออกของ mRNA (รูปที่ 3F) ซึ่งควบคุมการยืดตัวและการหยุดการแปลของเปปไทด์เฉพาะอย่างเลือกสรร 42 โดยสรุป ข้อมูลของเราชี้ให้เห็นว่าสัดส่วนโมลของโปรตีนไรโบโซมในกล้ามเนื้อโครงร่างแสดงให้เห็นถึงความไม่สม่ำเสมอ ส่งผลให้เกิดความแตกต่างระหว่างเส้นใยกล้ามเนื้อโครงร่าง
ขั้นตอนต่อไปคือการระบุลักษณะเฉพาะของเส้นใยกล้ามเนื้อหดตัวเร็วและหดตัวช้า และสำรวจกลไกการควบคุมการถอดรหัสของเส้นใยเหล่านั้น เมื่อเปรียบเทียบกลุ่มเส้นใยกล้ามเนื้อหดตัวเร็วและหดตัวช้าที่กำหนดโดย UMAP ในชุดข้อมูลทั้งสองชุด (รูปที่ 1G–H และ 4A–B) การวิเคราะห์ทางทรานสคริปโตมิกและโปรตีโอมิกส์ระบุคุณลักษณะที่มีความอุดมสมบูรณ์แตกต่างกัน 1366 และ 804 รายการ ตามลำดับ (รูปที่ 4A–B ชุดข้อมูลเสริม 9–12) เราสังเกตเห็นความแตกต่างที่คาดไว้ในลักษณะเฉพาะที่เกี่ยวข้องกับซาร์โคเมียร์ (เช่น โทรโปไมโอซินและโทรโปนิน) การเชื่อมโยงการกระตุ้นและการหดตัว (ไอโซฟอร์ม SERCA) และการเผาผลาญพลังงาน (เช่น ALDOA และ CKB) นอกจากนี้ ทรานสคริปต์และโปรตีนที่ควบคุมการยูบิควิตินของโปรตีนยังมีการแสดงออกที่แตกต่างกันในเส้นใยกล้ามเนื้อหดตัวเร็วและหดตัวช้า (เช่น USP54, SH3RF2, USP28 และ USP48) (รูปที่ 4A–B) นอกจากนี้ ยีนโปรตีนจุลินทรีย์ RP11-451G4.2 (DWORF) ซึ่งก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่ามีการแสดงออกที่แตกต่างกันในเส้นใยกล้ามเนื้อลูกแกะประเภทต่างๆ43 และช่วยเพิ่มกิจกรรม SERCA ในกล้ามเนื้อหัวใจ44 มีการแสดงออกเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในเส้นใยกล้ามเนื้อโครงร่างแบบช้า (รูปที่ 4A) ในทำนองเดียวกัน ในระดับเส้นใยแต่ละเส้น พบความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในลายเซ็นที่รู้จักกันดี เช่น ไอโซฟอร์มของแลคเตทดีไฮโดรจีเนสที่เกี่ยวข้องกับการเผาผลาญ (LDHA และ LDHB รูปที่ 4C และรูปเพิ่มเติมที่ 8A)45,46 รวมถึงลายเซ็นเฉพาะประเภทเส้นใยที่ไม่เคยรู้จักมาก่อน (เช่น IRX3, USP54, USP28 และ DPYSL3) (รูปที่ 4C) มีการทับซ้อนกันอย่างมีนัยสำคัญของลักษณะที่แสดงออกแตกต่างกันระหว่างชุดข้อมูลทรานสคริปโตมิกและโปรตีโอมิก (ภาพประกอบเพิ่มเติม 8B) รวมถึงความสัมพันธ์ของการเปลี่ยนแปลงแบบเท่าตัวซึ่งส่วนใหญ่เกิดจากการแสดงออกที่แตกต่างกันอย่างเด่นชัดของลักษณะซาร์โคเมียร์ (ภาพประกอบเพิ่มเติม 8C) ที่น่าสังเกตคือ ลายเซ็นบางอย่าง (เช่น USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) แสดงให้เห็นถึงการควบคุมหลังการถอดรหัสที่แข็งแกร่งเฉพาะในระดับโปรตีโอมิกเท่านั้น และมีโปรไฟล์การแสดงออกที่เฉพาะเจาะจงสำหรับเส้นใยกล้ามเนื้อหดตัวช้า/เร็ว (ภาพประกอบเพิ่มเติม 8C)
A และ B แสดงแผนภูมิภูเขาไฟเปรียบเทียบคลัสเตอร์ช้าและเร็วที่ระบุโดยแผนภูมิการประมาณและการฉายภาพแมนิโฟลด์แบบสม่ำเสมอ (UMAP) ในรูปที่ 1G–H จุดสีแสดงถึงทรานสคริปต์หรือโปรตีนที่แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญที่ FDR < 0.05 และจุดที่เข้มกว่าแสดงถึงทรานสคริปต์หรือโปรตีนที่แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญที่การเปลี่ยนแปลงลอการิทึม > 1 การวิเคราะห์ทางสถิติแบบสองทางดำเนินการโดยใช้การทดสอบ Wald ของ DESeq2 พร้อมค่า p ที่ปรับโดย Benjamini–Hochberg (ทรานสคริปโตมิกส์) หรือวิธีการแบบจำลองเชิงเส้น Limma พร้อมการวิเคราะห์แบบเบย์เซียนเชิงประจักษ์ตามด้วยการปรับ Benjamini–Hochberg สำหรับการเปรียบเทียบหลายรายการ (โปรตีโอมิกส์) C แผนภูมิลายเซ็นของยีนหรือโปรตีนที่แสดงออกแตกต่างกันที่เลือกไว้ระหว่างเส้นใยช้าและเร็ว D การวิเคราะห์การเสริมคุณค่าของทรานสคริปต์และโปรตีนที่แสดงออกแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญ ค่าที่ทับซ้อนกันได้รับการเสริมคุณค่าในทั้งสองชุดข้อมูล ค่าทรานสคริปโตมได้รับการเสริมคุณค่าเฉพาะในทรานสคริปโตม และค่าโปรตีโอมได้รับการเสริมคุณค่าเฉพาะในโปรตีโอม การวิเคราะห์ทางสถิติได้ดำเนินการโดยใช้แพ็กเกจ clusterProfiler พร้อมค่า p ที่ปรับด้วยวิธี Benjamini-Hochberg E. ปัจจัยการถอดรหัสเฉพาะชนิดของเส้นใยที่ระบุโดย SCENIC โดยอิงจากคะแนนความจำเพาะของตัวควบคุมที่ได้จาก SCENIC และการแสดงออกของ mRNA ที่แตกต่างกันระหว่างชนิดของเส้นใย F. การสร้างโปรไฟล์ของปัจจัยการถอดรหัสที่เลือกซึ่งแสดงออกแตกต่างกันระหว่างเส้นใยช้าและเส้นใยเร็ว
จากนั้นเราได้ทำการวิเคราะห์การแสดงออกเกินของยีนและโปรตีนที่มีการแสดงออกแตกต่างกัน (รูปที่ 4D ชุดข้อมูลเสริม 13) การเสริมคุณค่าของเส้นทางสำหรับคุณลักษณะที่แตกต่างกันระหว่างชุดข้อมูลทั้งสองเผยให้เห็นความแตกต่างที่คาดไว้ เช่น กระบวนการ β-ออกซิเดชันของกรดไขมันและกระบวนการเผาผลาญคีโตน (เส้นใยช้า) การหดตัวของไมโอฟิลาเมนต์/กล้ามเนื้อ (เส้นใยเร็วและเส้นใยช้าตามลำดับ) และกระบวนการสลายคาร์โบไฮเดรต (เส้นใยเร็ว) กิจกรรมของโปรตีนฟอสฟาเตสเซริน/ทรีโอนีนก็เพิ่มสูงขึ้นในเส้นใยเร็วเช่นกัน ซึ่งขับเคลื่อนโดยคุณลักษณะต่างๆ เช่น หน่วยย่อยฟอสฟาเตสควบคุมและเร่งปฏิกิริยา (PPP3CB, PPP1R3D และ PPP1R3A) ซึ่งเป็นที่ทราบกันดีว่าควบคุมการเผาผลาญไกลโคเจน (47) (รูปเสริม 8D–E) เส้นทางอื่นๆ ที่อุดมไปด้วยเส้นใยเร็ว ได้แก่ การประมวลผล (P-) ร่างกาย (YTHDF3, TRIM21, LSM2) ในโปรตีโอม (ภาพประกอบเพิ่มเติม 8F) ซึ่งอาจเกี่ยวข้องกับการควบคุมหลังการถอดรหัส (48) และกิจกรรมของปัจจัยการถอดรหัส (SREBF1, RXRG, RORA) ในทรานสคริปโตม (ภาพประกอบเพิ่มเติม 8G) เส้นใยช้าอุดมไปด้วยกิจกรรมออกซิโดรีดักเทส (BDH1, DCXR, TXN2) (ภาพประกอบเพิ่มเติม 8H) การจับอะไมด์ (CPTP, PFDN2, CRYAB) (ภาพประกอบเพิ่มเติม 8I) เมทริกซ์นอกเซลล์ (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (ภาพประกอบเพิ่มเติม 8J) และกิจกรรมตัวรับ-ลิแกนด์ (FNDC5, SPX, NENF) (ภาพประกอบเพิ่มเติม 8K)
เพื่อให้ได้ข้อมูลเชิงลึกเพิ่มเติมเกี่ยวกับการควบคุมการถอดรหัสที่อยู่เบื้องหลังลักษณะเฉพาะของเส้นใยกล้ามเนื้อชนิดช้า/เร็ว เราได้ทำการวิเคราะห์การเสริมความเข้มข้นของปัจจัยการถอดรหัสโดยใช้ SCENIC49 (ชุดข้อมูลเสริม 14) ปัจจัยการถอดรหัสหลายตัวมีการเสริมความเข้มข้นอย่างมีนัยสำคัญระหว่างเส้นใยกล้ามเนื้อชนิดเร็วและช้า (รูปที่ 4E) ซึ่งรวมถึงปัจจัยการถอดรหัสเช่น MAFA ซึ่งก่อนหน้านี้เชื่อมโยงกับการพัฒนาเส้นใยกล้ามเนื้อชนิดเร็ว50 รวมถึงปัจจัยการถอดรหัสหลายตัวที่ก่อนหน้านี้ไม่ได้เกี่ยวข้องกับโปรแกรมยีนเฉพาะชนิดของเส้นใยกล้ามเนื้อ ในบรรดาปัจจัยเหล่านี้ PITX1, EGR1 และ MYF6 เป็นปัจจัยการถอดรหัสที่มีการเสริมความเข้มข้นมากที่สุดในเส้นใยกล้ามเนื้อชนิดเร็ว (รูปที่ 4E) ในทางตรงกันข้าม ZSCAN30 และ EPAS1 (หรือที่รู้จักกันในชื่อ HIF2A) เป็นปัจจัยการถอดรหัสที่มีการเสริมความเข้มข้นมากที่สุดในเส้นใยกล้ามเนื้อชนิดช้า (รูปที่ 4E) สอดคล้องกับเรื่องนี้ MAFA มีการแสดงออกในระดับที่สูงกว่าในบริเวณ UMAP ที่สอดคล้องกับเส้นใยกล้ามเนื้อชนิดเร็ว ในขณะที่ EPAS1 มีรูปแบบการแสดงออกตรงกันข้าม (รูปที่ 4F)
นอกเหนือจากยีนที่เข้ารหัสโปรตีนที่เป็นที่รู้จักแล้ว ยังมี RNA ไบโอไทป์ที่ไม่เข้ารหัสจำนวนมากที่อาจเกี่ยวข้องกับการควบคุมการพัฒนาและการเกิดโรคในมนุษย์ 51, 52 ในชุดข้อมูลทรานสคริปโตม RNA ที่ไม่เข้ารหัสหลายชนิดแสดงความจำเพาะต่อชนิดของเส้นใย (รูปที่ 5A และชุดข้อมูลเสริม 15) รวมถึง LINC01405 ซึ่งมีความจำเพาะสูงต่อเส้นใยช้าและมีรายงานว่าลดลงในกล้ามเนื้อของผู้ป่วยที่เป็นโรคกล้ามเนื้อไมโทคอนเดรีย 53 ในทางตรงกันข้าม RP11-255P5.3 ซึ่งสอดคล้องกับยีน lnc-ERCC5-5 (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2) 54 แสดงความจำเพาะต่อชนิดของเส้นใยเร็ว ทั้ง LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) และ RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) แสดงความจำเพาะต่อกล้ามเนื้อโครงร่าง (ภาพประกอบเพิ่มเติม 9A–B) และไม่มีจีนหดตัวที่รู้จักอยู่ในบริเวณใกล้เคียงจีโนม 1 Mb ซึ่งบ่งชี้ว่าพวกมันมีบทบาทเฉพาะในการควบคุมชนิดของเส้นใยกล้ามเนื้อมากกว่าการควบคุมจีนหดตัวที่อยู่ใกล้เคียง โปรไฟล์การแสดงออกที่จำเพาะต่อชนิดของเส้นใยกล้ามเนื้อช้า/เร็วของ LINC01405 และ RP11-255P5.3 ตามลำดับ ได้รับการยืนยันโดยใช้ RNAscope (ภาพที่ 5B–C)
A. การถอดรหัส RNA ที่ไม่เข้ารหัสมีการควบคุมอย่างมีนัยสำคัญในเส้นใยกล้ามเนื้อแบบหดตัวช้าและแบบหดตัวเร็ว B. ภาพ RNAscope ตัวอย่างที่แสดงความจำเพาะของชนิดเส้นใยกล้ามเนื้อแบบหดตัวช้าและแบบหดตัวเร็วของ LINC01405 และ RP11-255P5.3 ตามลำดับ แถบมาตราส่วน = 50 μm C. การหาปริมาณการแสดงออกของ RNA ที่ไม่เข้ารหัสที่จำเพาะต่อชนิดของเส้นใยกล้ามเนื้อตามที่กำหนดโดย RNAscope (n = 3 ตัวอย่างชิ้นเนื้อจากบุคคลอิสระ เปรียบเทียบเส้นใยกล้ามเนื้อแบบหดตัวเร็วและแบบหดตัวช้าภายในแต่ละบุคคล) การวิเคราะห์ทางสถิติทำโดยใช้การทดสอบ t ของนักเรียนแบบสองด้าน แผนภาพกล่องแสดงค่ามัธยฐานและควาร์ไทล์ที่หนึ่งและที่สาม โดยมีหนวดชี้ไปยังค่าต่ำสุดและสูงสุด D. ขั้นตอนการระบุโปรตีนจุลินทรีย์แบบ de novo (สร้างด้วย BioRender.com) E. โปรตีนจุลินทรีย์ LINC01405_ORF408:17441:17358 แสดงออกอย่างจำเพาะเจาะจงในเส้นใยกล้ามเนื้อโครงร่างชนิดช้า (n=5 ตัวอย่างชิ้นเนื้อจากผู้เข้าร่วมอิสระ โดยเปรียบเทียบเส้นใยกล้ามเนื้อชนิดเร็วและชนิดช้าในผู้เข้าร่วมแต่ละคน) การวิเคราะห์ทางสถิติทำโดยใช้วิธีแบบจำลองเชิงเส้นของ Limm ร่วมกับวิธีการแบบเบย์เซียนเชิงประจักษ์ ตามด้วยวิธีการ Benjamini-Hochberg สำหรับการเปรียบเทียบหลายกลุ่มพร้อมการปรับค่า p-value แผนภาพกล่องแสดงค่ามัธยฐาน ควาร์ไทล์ที่หนึ่งและที่สาม โดยมีหนวดชี้ไปยังค่าสูงสุด/ต่ำสุด
งานวิจัยล่าสุดแสดงให้เห็นว่าทรานสคริปต์ที่ไม่เข้ารหัสจำนวนมากเข้ารหัสโปรตีนจุลินทรีย์ที่ถูกถอดรหัส ซึ่งบางส่วนควบคุมการทำงานของกล้ามเนื้อ 44, 55 เพื่อระบุโปรตีนจุลินทรีย์ที่มีศักยภาพในการจำเพาะต่อชนิดของเส้นใย เราได้ค้นหาชุดข้อมูลโปรตีโอมของเส้นใย 1000 เส้นโดยใช้ไฟล์ FASTA ที่กำหนดเองซึ่งมีลำดับของทรานสคริปต์ที่ไม่เข้ารหัส (n = 305) ที่พบในชุดข้อมูลทรานสคริปโตมของเส้นใย 1000 เส้น (รูปที่ 5D) เราได้ระบุโปรตีนจุลินทรีย์ 197 ชนิดจากทรานสคริปต์ที่แตกต่างกัน 22 ชนิด โดย 71 ชนิดมีการควบคุมที่แตกต่างกันระหว่างเส้นใยกล้ามเนื้อโครงร่างแบบช้าและแบบเร็ว (รูปภาพเสริม 9C และชุดข้อมูลเสริม 16) สำหรับ LINC01405 พบผลิตภัณฑ์โปรตีนจุลินทรีย์ 3 ชนิด โดยหนึ่งในนั้นแสดงความจำเพาะต่อเส้นใยแบบช้าคล้ายกับทรานสคริปต์ (รูปที่ 5E และรูปภาพเสริม 9D) ดังนั้น เราจึงระบุ LINC01405 ว่าเป็นยีนที่เข้ารหัสโปรตีนจุลินทรีย์จำเพาะสำหรับเส้นใยกล้ามเนื้อโครงร่างชนิดช้า
เราได้พัฒนากระบวนการทำงานที่ครอบคลุมสำหรับการวิเคราะห์โปรตีนในระดับใหญ่ของเส้นใยกล้ามเนื้อแต่ละเส้น และระบุตัวควบคุมความหลากหลายของเส้นใยในสภาวะปกติ เราได้ประยุกต์ใช้กระบวนการทำงานนี้เพื่อทำความเข้าใจว่าโรคกล้ามเนื้อเนมาไลน์ส่งผลต่อความหลากหลายของเส้นใยกล้ามเนื้อโครงร่างอย่างไร โรคกล้ามเนื้อเนมาไลน์เป็นโรคกล้ามเนื้อที่ถ่ายทอดทางพันธุกรรมซึ่งทำให้กล้ามเนื้ออ่อนแรง และในเด็กที่ได้รับผลกระทบจะมีภาวะแทรกซ้อนหลายอย่างรวมถึงภาวะหายใจลำบาก กระดูกสันหลังคด และการเคลื่อนไหวของแขนขาที่จำกัด 19,20 โดยทั่วไป ในโรคกล้ามเนื้อเนมาไลน์ การกลายพันธุ์ที่ก่อโรคในยีนเช่น actin alpha 1 (ACTA1) ส่งผลให้องค์ประกอบของเส้นใยกล้ามเนื้อแบบหดตัวช้ามีมากกว่า แม้ว่าผลกระทบนี้จะแตกต่างกันไปก็ตาม ข้อยกเว้นที่น่าสังเกตอย่างหนึ่งคือ โรคกล้ามเนื้อเนมาไลน์โทรโปนิน T1 (TNNT1) ซึ่งมีเส้นใยแบบหดตัวเร็วมีมากกว่า ดังนั้น การทำความเข้าใจความแตกต่างหลากหลายที่อยู่เบื้องหลังความผิดปกติของเส้นใยกล้ามเนื้อโครงร่างที่พบในโรคกล้ามเนื้อเนมาไลน์ให้ดียิ่งขึ้น อาจช่วยไขความสัมพันธ์ที่ซับซ้อนระหว่างโรคเหล่านี้กับชนิดของเส้นใยกล้ามเนื้อได้
เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุมที่มีสุขภาพดี (n=3 ต่อกลุ่ม) เส้นใยกล้ามเนื้อที่แยกได้จากผู้ป่วยโรคกล้ามเนื้ออ่อนแรงชนิดเนมาไลน์ที่มีการกลายพันธุ์ในยีน ACTA1 และ TNNT1 แสดงให้เห็นถึงการฝ่อหรือเสื่อมสภาพของเส้นใยกล้ามเนื้ออย่างเห็นได้ชัด (รูปที่ 6A ตารางเสริม 3) ซึ่งก่อให้เกิดความท้าทายทางเทคนิคอย่างมากสำหรับการวิเคราะห์โปรตีนเนื่องจากปริมาณวัสดุที่มีอยู่อย่างจำกัด อย่างไรก็ตาม เราสามารถตรวจพบโปรตีนได้ 2485 ชนิดในเส้นใยกล้ามเนื้อโครงร่าง 272 เส้น หลังจากกรองโปรตีนที่วัดปริมาณได้อย่างน้อย 1000 ชนิดต่อเส้นใยแล้ว เส้นใย 250 เส้นถูกนำไปวิเคราะห์ทางชีวสารสนเทศต่อไป หลังจากกรองแล้ว สามารถวัดปริมาณโปรตีนได้เฉลี่ย 1573 ± 359 ชนิดต่อเส้นใย (รูปเสริม 10A ชุดข้อมูลเสริม 17–18) ที่น่าสังเกตคือ แม้ขนาดของเส้นใยจะลดลงอย่างมาก แต่ความลึกของโปรตีนในตัวอย่างผู้ป่วยโรคกล้ามเนื้ออ่อนแรงชนิดเนมาไลน์ลดลงเพียงเล็กน้อยเท่านั้น นอกจากนี้ การประมวลผลข้อมูลเหล่านี้โดยใช้ไฟล์ FASTA ของเราเอง (รวมถึงทรานสคริปต์ที่ไม่เข้ารหัส) ทำให้เราสามารถระบุโปรตีนจุลินทรีย์ 5 ชนิดในเส้นใยกล้ามเนื้อโครงร่างจากผู้ป่วยโรคกล้ามเนื้ออ่อนแรงชนิดเนมาไลน์ได้ (ชุดข้อมูลเสริม 19) ช่วงไดนามิกของโปรตีโอมนั้นกว้างขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ และโปรตีนทั้งหมดในกลุ่มควบคุมมีความสัมพันธ์ที่ดีกับผลลัพธ์ของการวิเคราะห์โปรตีโอม 1,000 เส้นใยก่อนหน้านี้ (ภาพประกอบเสริม 10B–C)
A. ภาพจากกล้องจุลทรรศน์แสดงให้เห็นการฝ่อหรือเสื่อมสภาพของเส้นใยกล้ามเนื้อ และความเด่นของเส้นใยกล้ามเนื้อชนิดต่างๆ โดยพิจารณาจากค่า MYH ในโรคกล้ามเนื้ออ่อนแรงชนิดเนมาไลน์ (NM) ที่เกิดจากยีน ACTA1 และ TNNT1 แถบมาตราส่วน = 100 ไมโครเมตร เพื่อให้แน่ใจว่าการย้อมสีมีความน่าเชื่อถือในผู้ป่วย ACTA1 และ TNNT1 จึงทำการย้อมสีชิ้นเนื้อของผู้ป่วย 3 ราย จำนวน 2-3 ครั้ง (4 ส่วนต่อกรณี) ก่อนที่จะเลือกภาพที่เป็นตัวแทน B. สัดส่วนของเส้นใยกล้ามเนื้อในผู้เข้าร่วมการศึกษาโดยพิจารณาจากค่า MYH C. แผนภาพการวิเคราะห์ส่วนประกอบหลัก (PCA) ของเส้นใยกล้ามเนื้อโครงร่างในผู้ป่วยโรคกล้ามเนื้ออ่อนแรงชนิดเนมาไลน์และกลุ่มควบคุม D. เส้นใยกล้ามเนื้อโครงร่างจากผู้ป่วยที่เป็นโรคกล้ามเนื้ออ่อนแรงชนิดเนมาไลน์และกลุ่มควบคุม ฉายลงบนแผนภาพ PCA ที่กำหนดจากเส้นใย 1,000 เส้นที่วิเคราะห์ในรูปที่ 2 ตัวอย่างเช่น แผนภาพภูเขาไฟเปรียบเทียบความแตกต่างระหว่างผู้เข้าร่วมที่มีโรคกล้ามเนื้ออ่อนแรงชนิดเนมาไลน์ ACTA1 และ TNNT1 กับกลุ่มควบคุม และระหว่างผู้เข้าร่วมที่มีโรคกล้ามเนื้ออ่อนแรงชนิดเนมาไลน์ ACTA1 และ TNNT1 วงกลมสีแสดงถึงโปรตีนที่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญที่ π < 0.05 และจุดสีดำแสดงถึงโปรตีนที่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญที่ FDR < 0.05 การวิเคราะห์ทางสถิติทำโดยใช้วิธีแบบจำลองเชิงเส้น Limma และวิธี Bayesian เชิงประจักษ์ ตามด้วยการปรับค่า p สำหรับการเปรียบเทียบหลายรายการโดยใช้วิธี Benjamini-Hochberg H. การวิเคราะห์การเสริมคุณค่าของโปรตีนที่มีการแสดงออกแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญทั่วทั้งโปรตีโอมและในเส้นใยชนิดที่ 1 และ 2A การวิเคราะห์ทางสถิติได้ดำเนินการโดยใช้แพ็กเกจ clusterProfiler และค่า p ที่ปรับด้วยวิธี Benjamini-Hochberg I, J. แผนภาพการวิเคราะห์องค์ประกอบหลัก (PCA) ที่ระบายสีตามคำศัพท์ทางชีววิทยาของยีน (GO) ของเมทริกซ์นอกเซลล์และไมโทคอนเดรีย
เนื่องจากโรคกล้ามเนื้ออ่อนแรงชนิดเนมาไลน์สามารถส่งผลต่อสัดส่วนของชนิดเส้นใยกล้ามเนื้อที่แสดงออก MYH ในกล้ามเนื้อโครงร่างได้^19,20 เราจึงตรวจสอบชนิดเส้นใยกล้ามเนื้อที่แสดงออก MYH ในผู้ป่วยโรคกล้ามเนื้ออ่อนแรงชนิดเนมาไลน์และกลุ่มควบคุมก่อน เรากำหนดชนิดของเส้นใยกล้ามเนื้อโดยใช้วิธีการที่ไม่ลำเอียงซึ่งได้อธิบายไว้ก่อนหน้านี้สำหรับการทดสอบเส้นใยกล้ามเนื้อ 1,000 เส้น (ภาพประกอบเพิ่มเติม 10D–E) และอีกครั้งที่ไม่สามารถระบุเส้นใยกล้ามเนื้อ 2X บริสุทธิ์ได้ (รูปที่ 6B) เราสังเกตเห็นผลกระทบที่แตกต่างกันของโรคกล้ามเนื้ออ่อนแรงชนิดเนมาไลน์ต่อชนิดของเส้นใยกล้ามเนื้อ เนื่องจากผู้ป่วยสองรายที่มีการกลายพันธุ์ของ ACTA1 มีสัดส่วนของเส้นใยกล้ามเนื้อชนิดที่ 1 เพิ่มขึ้น ในขณะที่ผู้ป่วยสองรายที่เป็นโรคกล้ามเนื้ออ่อนแรงชนิดเนมาไลน์ TNNT1 มีสัดส่วนของเส้นใยกล้ามเนื้อชนิดที่ 1 ลดลง (รูปที่ 6B) อันที่จริง การแสดงออกของ MYH2 และไอโซฟอร์มโทรโปนินเร็ว (TNNC2, TNNI2 และ TNNT3) ลดลงในโรคกล้ามเนื้ออ่อนแรงชนิดเนมาไลน์ ACTA1 ในขณะที่การแสดงออกของ MYH7 ลดลงในโรคกล้ามเนื้ออ่อนแรงชนิดเนมาไลน์ TNNT1 (ภาพประกอบเพิ่มเติม 11A) ซึ่งสอดคล้องกับรายงานก่อนหน้านี้เกี่ยวกับการเปลี่ยนแปลงชนิดของเส้นใยกล้ามเนื้อที่ไม่เป็นเนื้อเดียวกันในโรคกล้ามเนื้ออ่อนแรงชนิดเนมาไลน์19,20 เรายืนยันผลลัพธ์เหล่านี้ด้วยการตรวจทางภูมิคุ้มกันเคมี และพบว่าผู้ป่วยที่เป็นโรคกล้ามเนื้ออ่อนแรงชนิดเนมาไลน์ ACTA1 มีเส้นใยกล้ามเนื้อชนิดที่ 1 เป็นหลัก ในขณะที่ผู้ป่วยที่เป็นโรคกล้ามเนื้ออ่อนแรงชนิดเนมาไลน์ TNNT1 มีรูปแบบตรงกันข้าม (ภาพที่ 6A)
ในระดับโปรตีนของเส้นใยกล้ามเนื้อเดี่ยว เส้นใยกล้ามเนื้อโครงร่างจากผู้ป่วยโรคกล้ามเนื้ออ่อนแรงชนิดเนมาไลน์ ACTA1 และ TNNT1 รวมกลุ่มกับเส้นใยส่วนใหญ่จากกลุ่มควบคุม โดยทั่วไปแล้วเส้นใยจากผู้ป่วยโรคกล้ามเนื้ออ่อนแรงชนิดเนมาไลน์ TNNT1 จะได้รับผลกระทบอย่างรุนแรงที่สุด (รูปที่ 6C) สิ่งนี้เห็นได้ชัดเจนเป็นพิเศษเมื่อพล็อตแผนภาพการวิเคราะห์องค์ประกอบหลัก (PCA) ของเส้นใยที่ขยายใหญ่ขึ้นสำหรับผู้ป่วยแต่ละราย โดยผู้ป่วยโรคกล้ามเนื้ออ่อนแรงชนิดเนมาไลน์ TNNT1 รายที่ 2 และ 3 ปรากฏอยู่ห่างจากตัวอย่างควบคุมมากที่สุด (รูปภาพเสริม 11B, ชุดข้อมูลเสริม 20) เพื่อให้เข้าใจได้ดีขึ้นว่าเส้นใยจากผู้ป่วยโรคกล้ามเนื้ออ่อนแรงเปรียบเทียบกับเส้นใยที่แข็งแรงอย่างไร เราใช้ข้อมูลโดยละเอียดที่ได้จากการวิเคราะห์โปรตีนของเส้นใย 1,000 เส้นจากผู้เข้าร่วมที่เป็นผู้ใหญ่ที่มีสุขภาพดี เราฉายภาพเส้นใยจากชุดข้อมูลโรคกล้ามเนื้ออ่อนแรง (ผู้ป่วยโรคกล้ามเนื้ออ่อนแรงชนิดเนมาไลน์ ACTA1 และ TNNT1 และกลุ่มควบคุม) ลงบนแผนภาพ PCA ที่ได้จากการวิเคราะห์โปรตีนของเส้นใย 1,000 เส้น (รูปที่ 6D) การกระจายตัวของชนิดเส้นใย MYH ตามแกน PC2 ในเส้นใยควบคุมนั้นคล้ายคลึงกับการกระจายตัวของเส้นใยที่ได้จากการวิเคราะห์โปรตีนในเส้นใย 1,000 เส้น อย่างไรก็ตาม เส้นใยส่วนใหญ่ในผู้ป่วยโรคกล้ามเนื้ออ่อนแรงชนิดเนมาไลน์มีการเลื่อนลงมาตามแกน PC2 และทับซ้อนกับเส้นใยหดตัวเร็วที่แข็งแรง โดยไม่คำนึงถึงชนิดเส้นใย MYH ดั้งเดิม ดังนั้น แม้ว่าผู้ป่วยโรคกล้ามเนื้ออ่อนแรงชนิดเนมาไลน์ ACTA1 จะแสดงการเปลี่ยนแปลงไปสู่เส้นใยชนิดที่ 1 เมื่อวัดปริมาณโดยใช้วิธีการที่อิงตาม MYH แต่ทั้งโรคกล้ามเนื้ออ่อนแรงชนิดเนมาไลน์ ACTA1 และ TNNT1 ก็ทำให้โปรตีนในเส้นใยกล้ามเนื้อโครงร่างเปลี่ยนไปสู่เส้นใยหดตัวเร็ว
จากนั้นเราได้เปรียบเทียบกลุ่มผู้ป่วยแต่ละกลุ่มโดยตรงกับกลุ่มควบคุมที่มีสุขภาพดี และระบุโปรตีนที่มีการแสดงออกแตกต่างกัน 256 และ 552 ชนิดในโรคกล้ามเนื้ออ่อนแรงชนิดเนมาไลน์ ACTA1 และ TNNT1 ตามลำดับ (รูปที่ 6E–G และรูปเพิ่มเติมที่ 11C ชุดข้อมูลเสริม 21) การวิเคราะห์การเสริมคุณค่าของยีนเผยให้เห็นการลดลงอย่างสอดคล้องกันของโปรตีนไมโทคอนเดรีย (รูปที่ 6H–I ชุดข้อมูลเสริม 22) ที่น่าประหลาดใจคือ แม้ว่าชนิดของเส้นใยกล้ามเนื้อจะเด่นแตกต่างกันในโรคกล้ามเนื้ออ่อนแรงชนิดเนมาไลน์ ACTA1 และ TNNT1 แต่การลดลงนี้เป็นอิสระอย่างสมบูรณ์จากชนิดของเส้นใยกล้ามเนื้อที่อิงตาม MYH (รูปที่ 6H และรูปเพิ่มเติมที่ 11D–I ชุดข้อมูลเสริม 23) นอกจากนี้ยังพบโปรตีนจุลินทรีย์ 3 ชนิดที่มีการควบคุมในโรคกล้ามเนื้ออ่อนแรงชนิดเนมาไลน์ ACTA1 หรือ TNNT1 ด้วย ไมโครโปรตีนสองชนิดนี้ ได้แก่ ENSG00000215483_TR14_ORF67 (หรือที่รู้จักกันในชื่อ LINC00598 หรือ Lnc-FOXO1) และ ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2) แสดงให้เห็นความอุดมสมบูรณ์ที่แตกต่างกันเฉพาะในเส้นใยกล้ามเนื้อชนิดที่ 1 เท่านั้น ก่อนหน้านี้มีรายงานว่า ENSG00000215483_TR14_ORF67 มีบทบาทในการควบคุมวงจรเซลล์ 56 ​​ในทางกลับกัน ENSG00000232046_TR1_ORF437 (ซึ่งตรงกับ LINC01798) มีปริมาณเพิ่มขึ้นทั้งในเส้นใยกล้ามเนื้อชนิดที่ 1 และชนิดที่ 2A ในผู้ป่วย ACTA1-nemaline myopathy เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุมที่มีสุขภาพดี (ภาพประกอบเพิ่มเติม 12A, ชุดข้อมูลเพิ่มเติม 24) ในทางตรงกันข้าม โปรตีนไรโบโซมส่วนใหญ่ไม่ได้รับผลกระทบจากโรคกล้ามเนื้ออ่อนแรงชนิดเนมาไลน์ แม้ว่า RPS17 จะถูกลดระดับลงในโรคกล้ามเนื้ออ่อนแรงชนิดเนมาไลน์ ACTA1 ก็ตาม (รูปที่ 6E)
การวิเคราะห์การเสริมคุณค่าเผยให้เห็นการเพิ่มขึ้นของกระบวนการระบบภูมิคุ้มกันในโรคกล้ามเนื้ออ่อนแรงชนิดเนมาไลน์ ACTA1 และ TNNT1 ในขณะที่การยึดเกาะของเซลล์ก็เพิ่มขึ้นในโรคกล้ามเนื้ออ่อนแรงชนิดเนมาไลน์ TNNT1 เช่นกัน (รูปที่ 6H) การเสริมคุณค่าของปัจจัยนอกเซลล์เหล่านี้สะท้อนให้เห็นโดยโปรตีนเมทริกซ์นอกเซลล์ที่ทำให้ PCA ใน PC1 และ PC2 เปลี่ยนไปในทิศทางลบ (เช่น ไปทางเส้นใยที่ได้รับผลกระทบมากที่สุด) (รูปที่ 6J) ผู้ป่วยทั้งสองกลุ่มแสดงให้เห็นการแสดงออกที่เพิ่มขึ้นของโปรตีนนอกเซลล์ที่เกี่ยวข้องกับการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันและกลไกการซ่อมแซมซาร์โคเลมมา เช่น แอนเน็กซิน (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 และโปรตีนที่ทำปฏิกิริยากับพวกมัน S100A1159 (รูปภาพเสริม 12B–C) กระบวนการนี้เคยมีรายงานว่าเพิ่มขึ้นในโรคกล้ามเนื้อเสื่อม60 แต่เท่าที่เรารู้ ยังไม่เคยมีการเชื่อมโยงกับโรคกล้ามเนื้ออ่อนแรงชนิดเนมาไลน์มาก่อน การทำงานปกติของกลไกโมเลกุลนี้มีความจำเป็นสำหรับการซ่อมแซมซาร์โคเลมมาภายหลังการบาดเจ็บ และสำหรับการรวมตัวของเซลล์กล้ามเนื้อที่เกิดขึ้นใหม่กับไมโอไฟเบอร์58,61 ดังนั้น กิจกรรมที่เพิ่มขึ้นของกระบวนการนี้ในกลุ่มผู้ป่วยทั้งสองกลุ่มจึงบ่งชี้ถึงการตอบสนองในการซ่อมแซมต่อการบาดเจ็บที่เกิดจากความไม่เสถียรของไมโอไฟเบอร์
ผลกระทบของโรคกล้ามเนื้ออ่อนแรงชนิดเนมาไลน์แต่ละชนิดมีความสัมพันธ์กันดี (r = 0.736) และแสดงให้เห็นถึงการทับซ้อนกันในระดับที่เหมาะสม (ภาพประกอบเพิ่มเติม 11A–B) ซึ่งบ่งชี้ว่าโรคกล้ามเนื้ออ่อนแรงชนิดเนมาไลน์ ACTA1 และ TNNT1 มีผลกระทบต่อโปรตีนในร่างกายคล้ายคลึงกัน อย่างไรก็ตาม โปรตีนบางชนิดได้รับการควบคุมเฉพาะในโรคกล้ามเนื้ออ่อนแรงชนิดเนมาไลน์ ACTA1 หรือ TNNT1 เท่านั้น (ภาพประกอบเพิ่มเติม 11A และ C) โปรตีนที่ก่อให้เกิดพังผืด MFAP4 เป็นหนึ่งในโปรตีนที่มีการเพิ่มขึ้นมากที่สุดในโรคกล้ามเนื้ออ่อนแรงชนิดเนมาไลน์ TNNT1 แต่ยังคงไม่เปลี่ยนแปลงในโรคกล้ามเนื้ออ่อนแรงชนิดเนมาไลน์ ACTA1 ส่วน SKIC8 ซึ่งเป็นส่วนประกอบของคอมเพล็กซ์ PAF1C ที่ทำหน้าที่ควบคุมการถอดรหัสยีน HOX นั้น มีการลดลงในโรคกล้ามเนื้ออ่อนแรงชนิดเนมาไลน์ TNNT1 แต่ไม่ได้รับผลกระทบในโรคกล้ามเนื้ออ่อนแรงชนิดเนมาไลน์ ACTA1 (ภาพประกอบเพิ่มเติม 11A) การเปรียบเทียบโดยตรงระหว่างโรคกล้ามเนื้ออ่อนแรงชนิดเนมาไลน์ ACTA1 และ TNNT1 พบว่าโรคกล้ามเนื้ออ่อนแรงชนิดเนมาไลน์ TNNT1 มีการลดลงของโปรตีนไมโทคอนเดรียและเพิ่มขึ้นของโปรตีนระบบภูมิคุ้มกันมากกว่า (รูปที่ 6G–H และรูปเพิ่มเติมที่ 11C และ 11H–I) ข้อมูลเหล่านี้สอดคล้องกับการฝ่อ/เสื่อมสภาพที่รุนแรงกว่าที่พบในโรคกล้ามเนื้ออ่อนแรงชนิดเนมาไลน์ TNNT1 เมื่อเทียบกับโรคกล้ามเนื้ออ่อนแรงชนิดเนมาไลน์ TNNT1 (รูปที่ 6A) ซึ่งบ่งชี้ว่าโรคกล้ามเนื้ออ่อนแรงชนิดเนมาไลน์ TNNT1 เป็นรูปแบบที่รุนแรงกว่าของโรคนี้
เพื่อประเมินว่าผลกระทบที่สังเกตได้ของโรคกล้ามเนื้ออ่อนแรงชนิดเนมาไลน์ยังคงอยู่หรือไม่ในระดับกล้ามเนื้อทั้งหมด เราจึงทำการวิเคราะห์โปรตีนโดยรวมของชิ้นเนื้อกล้ามเนื้อจากกลุ่มผู้ป่วยโรคกล้ามเนื้ออ่อนแรงชนิดเนมาไลน์ TNNT1 กลุ่มเดียวกัน และเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม (กลุ่มละ 3 คน) (ภาพประกอบเพิ่มเติมที่ 13A, ชุดข้อมูลเพิ่มเติมที่ 25) ตามที่คาดไว้ กลุ่มควบคุมมีความสัมพันธ์กันอย่างใกล้ชิดในการวิเคราะห์องค์ประกอบหลัก ในขณะที่ผู้ป่วยโรคกล้ามเนื้ออ่อนแรงชนิดเนมาไลน์ TNNT1 แสดงความแปรปรวนระหว่างตัวอย่างที่สูงกว่า คล้ายกับที่พบในการวิเคราะห์เส้นใยเดี่ยว (ภาพประกอบเพิ่มเติมที่ 13B) การวิเคราะห์โดยรวมสามารถจำลองโปรตีนที่มีการแสดงออกแตกต่างกัน (ภาพประกอบเพิ่มเติมที่ 13C, ชุดข้อมูลเพิ่มเติมที่ 26) และกระบวนการทางชีวภาพ (ภาพประกอบเพิ่มเติมที่ 13D, ชุดข้อมูลเพิ่มเติมที่ 27) ที่เน้นโดยการเปรียบเทียบเส้นใยแต่ละเส้นได้ แต่สูญเสียความสามารถในการแยกแยะระหว่างเส้นใยประเภทต่างๆ และไม่สามารถอธิบายผลกระทบของโรคที่แตกต่างกันไปในแต่ละเส้นใยได้
โดยสรุปแล้ว ข้อมูลเหล่านี้แสดงให้เห็นว่าโปรตีโอมิกส์ระดับไมโอไฟเบอร์เดี่ยวสามารถอธิบายลักษณะทางชีววิทยาทางคลินิกที่ไม่สามารถตรวจพบได้ด้วยวิธีการเฉพาะเจาะจง เช่น อิมมูโนบลอตติง ยิ่งไปกว่านั้น ข้อมูลเหล่านี้ยังเน้นย้ำถึงข้อจำกัดของการใช้การจำแนกประเภทเส้นใยแอคติน (MYH) เพียงอย่างเดียวในการอธิบายการปรับตัวของฟีโนไทป์ แท้จริงแล้ว แม้ว่าการเปลี่ยนประเภทเส้นใยจะแตกต่างกันระหว่างโรคกล้ามเนื้ออ่อนแรงชนิดเนมาไลน์ที่เกิดจากแอคตินและโทรโปนิน แต่โรคกล้ามเนื้ออ่อนแรงชนิดเนมาไลน์ทั้งสองชนิดนี้ทำให้การจำแนกประเภทเส้นใย MYH แยกออกจากกระบวนการเผาผลาญของเส้นใยกล้ามเนื้อโครงร่าง ส่งผลให้โปรตีโอมของกล้ามเนื้อมีอัตราการเผาผลาญที่เร็วขึ้นและมีออกซิเดชันน้อยลง
ความแตกต่างของเซลล์มีความสำคัญอย่างยิ่งต่อการตอบสนองความต้องการที่หลากหลายของเนื้อเยื่อ ในกล้ามเนื้อโครงร่าง มักอธิบายความแตกต่างนี้ด้วยชนิดของเส้นใยที่มีลักษณะเฉพาะคือระดับการสร้างแรงและความเหนื่อยล้าที่แตกต่างกัน อย่างไรก็ตาม เป็นที่ชัดเจนว่านี่อธิบายได้เพียงส่วนเล็ก ๆ ของความแปรปรวนของเส้นใยกล้ามเนื้อโครงร่าง ซึ่งมีความแปรปรวน ซับซ้อน และหลากหลายมากกว่าที่เคยคิดไว้ ความก้าวหน้าทางเทคโนโลยีได้ช่วยให้เข้าใจปัจจัยที่ควบคุมเส้นใยกล้ามเนื้อโครงร่างได้ดียิ่งขึ้น ข้อมูลของเราชี้ให้เห็นว่าเส้นใยชนิด 2X อาจไม่ใช่ชนิดย่อยของเส้นใยกล้ามเนื้อโครงร่างที่แตกต่างกัน นอกจากนี้ เรายังระบุโปรตีนเมตาบอลิซึม โปรตีนไรโบโซม และโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับเซลล์ว่าเป็นปัจจัยหลักที่กำหนดความแตกต่างของเส้นใยกล้ามเนื้อโครงร่าง โดยการประยุกต์ใช้กระบวนการวิเคราะห์โปรตีนของเรากับตัวอย่างผู้ป่วยที่เป็นโรคกล้ามเนื้ออ่อนแรงจากพยาธิไส้เดือนฝอย เราได้แสดงให้เห็นเพิ่มเติมว่าการจำแนกชนิดเส้นใยโดยใช้ MYH ไม่ได้สะท้อนความแตกต่างของกล้ามเนื้อโครงร่างอย่างสมบูรณ์ โดยเฉพาะอย่างยิ่งเมื่อระบบถูกรบกวน อันที่จริง ไม่ว่าจะเป็นเส้นใยกล้ามเนื้อชนิดใดที่อิงตาม MYH โรคกล้ามเนื้อที่เกิดจากพยาธิไส้เดือนฝอยจะส่งผลให้เกิดการเปลี่ยนแปลงไปสู่เส้นใยกล้ามเนื้อที่เร็วขึ้นและมีกระบวนการออกซิเดชั่นน้อยลง
เส้นใยกล้ามเนื้อโครงร่างได้รับการจำแนกประเภทมาตั้งแต่ศตวรรษที่ 19 การวิเคราะห์แบบโอมิกส์ในปัจจุบันทำให้เราเริ่มเข้าใจถึงรูปแบบการแสดงออกของเส้นใย MYH ประเภทต่างๆ และการตอบสนองต่อสิ่งเร้าที่แตกต่างกัน ดังที่ได้อธิบายไว้ในที่นี้ วิธีการแบบโอมิกส์ยังมีข้อดีคือมีความไวในการวัดปริมาณตัวบ่งชี้ประเภทเส้นใยได้ดีกว่าวิธีการแบบดั้งเดิมที่ใช้แอนติบอดี โดยไม่ต้องอาศัยการวัดปริมาณตัวบ่งชี้เพียงตัวเดียว (หรือเพียงไม่กี่ตัว) เพื่อกำหนดประเภทของเส้นใยกล้ามเนื้อโครงร่าง เราใช้กระบวนการทำงานแบบทรานสคริปโตมิกส์และโปรตีโอมิกส์ที่เสริมกัน และบูรณาการผลลัพธ์เพื่อตรวจสอบการควบคุมการถอดรหัสและการควบคุมหลังการถอดรหัสของความหลากหลายของเส้นใยในเส้นใยกล้ามเนื้อโครงร่างของมนุษย์ กระบวนการทำงานนี้ส่งผลให้ไม่สามารถระบุเส้นใยประเภท 2X บริสุทธิ์ได้ในระดับโปรตีนในกล้ามเนื้อ vastus lateralis ของกลุ่มชายหนุ่มสุขภาพดีของเรา ซึ่งสอดคล้องกับการศึกษาเส้นใยเดี่ยวครั้งก่อนๆ ที่พบเส้นใย 2X บริสุทธิ์น้อยกว่า 1% ในกล้ามเนื้อ vastus lateralis ที่มีสุขภาพดี แม้ว่าควรจะมีการยืนยันในกล้ามเนื้ออื่นๆ ในอนาคตก็ตาม ความคลาดเคลื่อนระหว่างการตรวจพบเส้นใย 2X ที่เกือบจะบริสุทธิ์ในระดับ mRNA และเส้นใย 2A/2X ที่ผสมกันในระดับโปรตีนนั้นเป็นเรื่องที่น่าสงสัย การแสดงออกของ mRNA ของไอโซฟอร์ม MYH ไม่เป็นไปตามจังหวะเวลา⁶⁷ ซึ่งบ่งชี้ว่าเราไม่น่าจะ "พลาด" สัญญาณการเริ่มต้นของ MYH2 ในเส้นใย 2X ที่ดูเหมือนจะบริสุทธิ์ในระดับ RNA คำอธิบายที่เป็นไปได้ประการหนึ่ง แม้จะเป็นเพียงสมมติฐาน อาจเป็นความแตกต่างในความเสถียรของโปรตีนและ/หรือ mRNA ระหว่างไอโซฟอร์ม MYH อันที่จริง ไม่มีเส้นใยเร็วใดที่บริสุทธิ์ 100% สำหรับไอโซฟอร์ม MYH ใดๆ และยังไม่ชัดเจนว่าระดับการแสดงออกของ mRNA MYH1 ในช่วง 70–90% จะส่งผลให้มีความอุดมสมบูรณ์ของ MYH1 และ MYH2 เท่ากันในระดับโปรตีนหรือไม่ อย่างไรก็ตาม เมื่อพิจารณาทรานสคริปโตมหรือโปรตีโอมทั้งหมด การวิเคราะห์คลัสเตอร์สามารถระบุได้อย่างมั่นใจเพียงสองคลัสเตอร์ที่แตกต่างกันซึ่งแสดงถึงเส้นใยกล้ามเนื้อโครงร่างที่ช้าและเร็ว โดยไม่คำนึงถึงองค์ประกอบ MYH ที่แม่นยำของพวกมัน ผลลัพธ์นี้สอดคล้องกับการวิเคราะห์โดยใช้วิธีการถอดรหัสพันธุกรรมแบบนิวเคลียสเดี่ยว ซึ่งโดยทั่วไปจะระบุกลุ่มนิวเคลียสกล้ามเนื้อที่แตกต่างกันเพียงสองกลุ่มเท่านั้น 68, 69, 70 ยิ่งไปกว่านั้น แม้ว่าการศึกษาโปรตีโอมิกส์ก่อนหน้านี้จะระบุเส้นใยประเภท 2X แต่เส้นใยเหล่านี้ไม่ได้รวมกลุ่มแยกต่างหากจากเส้นใยเร็วอื่นๆ และแสดงโปรตีนที่มีความอุดมสมบูรณ์แตกต่างกันเพียงเล็กน้อยเมื่อเทียบกับเส้นใยประเภทอื่นๆ โดยพิจารณาจาก MYH 14 ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าเราควรกลับไปสู่มุมมองการจำแนกประเภทเส้นใยกล้ามเนื้อในต้นศตวรรษที่ 20 ซึ่งแบ่งเส้นใยกล้ามเนื้อโครงร่างของมนุษย์ออกเป็นสองกลุ่มโดยพิจารณาจากคุณสมบัติทางเมตาบอลิซึมและการหดตัว ไม่ใช่สามกลุ่มที่แตกต่างกันโดยพิจารณาจาก MYH 63
ที่สำคัญกว่านั้น ควรพิจารณาความแตกต่างของเส้นใยกล้ามเนื้อในหลายมิติ งานวิจัย “omics” ก่อนหน้านี้ได้ชี้ไปในทิศทางนี้ โดยแสดงให้เห็นว่าเส้นใยกล้ามเนื้อโครงร่างไม่ได้ก่อตัวเป็นกลุ่มที่แยกจากกัน แต่เรียงตัวกันอย่างต่อเนื่อง 11, 13, 14, 64, 71 ในที่นี้ เราแสดงให้เห็นว่า นอกเหนือจากความแตกต่างในคุณสมบัติการหดตัวและการเผาผลาญของกล้ามเนื้อโครงร่างแล้ว เส้นใยกล้ามเนื้อยังสามารถแยกแยะได้ด้วยคุณลักษณะที่เกี่ยวข้องกับปฏิสัมพันธ์ระหว่างเซลล์และการทำงานของกลไกการแปลโปรตีน อันที่จริง เราพบความแตกต่างของไรโบโซมในเส้นใยกล้ามเนื้อโครงร่าง ซึ่งมีส่วนทำให้เกิดความแตกต่างโดยไม่ขึ้นอยู่กับชนิดของเส้นใยแบบช้าและแบบเร็ว สาเหตุที่แท้จริงของความแตกต่างอย่างมากของเส้นใยกล้ามเนื้อนี้ ซึ่งเป็นอิสระจากชนิดของเส้นใยช้าและเร็ว ยังคงไม่ชัดเจน แต่อาจชี้ให้เห็นถึงการจัดระเบียบเชิงพื้นที่เฉพาะภายในมัดกล้ามเนื้อที่ตอบสนองต่อแรงและภาระเฉพาะอย่างเหมาะสม72 การสื่อสารเฉพาะเซลล์หรือเฉพาะอวัยวะกับเซลล์ชนิดอื่นในสภาพแวดล้อมจุลภาคของกล้ามเนื้อ73,74,75 หรือความแตกต่างในกิจกรรมของไรโบโซมภายในเส้นใยกล้ามเนื้อแต่ละเส้น อันที่จริง ไรโบโซมเฮเทอโรพลาสมี่ ไม่ว่าจะผ่านการแทนที่พาราโลจัสของ RPL3 และ RPL3L หรือที่ระดับ 2′O-เมทิลเลชั่นของ rRNA ได้แสดงให้เห็นว่ามีความเกี่ยวข้องกับการเจริญเติบโตของกล้ามเนื้อโครงร่าง76,77 การประยุกต์ใช้มัลติโอมิกและเชิงพื้นที่ร่วมกับการกำหนดลักษณะการทำงานของเส้นใยกล้ามเนื้อแต่ละเส้นจะช่วยพัฒนาความเข้าใจของเราเกี่ยวกับชีววิทยาของกล้ามเนื้อในระดับมัลติโอมิกให้ดียิ่งขึ้น78
จากการวิเคราะห์โปรตีโอมของเส้นใยกล้ามเนื้อเดี่ยวจากผู้ป่วยที่เป็นโรคกล้ามเนื้ออ่อนแรงชนิดเนมาไลน์ เรายังได้แสดงให้เห็นถึงประโยชน์ ประสิทธิผล และการประยุกต์ใช้โปรตีโอมิกส์ของเส้นใยกล้ามเนื้อเดี่ยวเพื่ออธิบายพยาธิสรีรวิทยาทางคลินิกของกล้ามเนื้อโครงร่าง ยิ่งไปกว่านั้น เมื่อเปรียบเทียบขั้นตอนการทำงานของเรากับการวิเคราะห์โปรตีโอมิกส์แบบองค์รวม เราสามารถแสดงให้เห็นว่าโปรตีโอมิกส์ของเส้นใยกล้ามเนื้อเดี่ยวให้ข้อมูลที่ลึกซึ้งเท่ากับโปรตีโอมิกส์ของเนื้อเยื่อแบบองค์รวม และขยายความลึกนี้โดยคำนึงถึงความแตกต่างระหว่างเส้นใยและชนิดของเส้นใยกล้ามเนื้อ นอกจากความแตกต่างที่คาดการณ์ไว้ (แม้ว่าจะมีความแปรปรวน) ในอัตราส่วนชนิดของเส้นใยที่พบในโรคกล้ามเนื้ออ่อนแรงชนิดเนมาไลน์ ACTA1 และ TNNT1 เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุมที่มีสุขภาพดี¹⁹ เรายังสังเกตเห็นการปรับโครงสร้างออกซิเดชันและนอกเซลล์ที่ไม่ขึ้นกับการเปลี่ยนชนิดของเส้นใยที่เกิดจาก MYH อีกด้วย ก่อนหน้านี้มีรายงานการเกิดพังผืดในโรคกล้ามเนื้ออ่อนแรงชนิดเนมาไลน์ TNNT1¹⁹ อย่างไรก็ตาม การวิเคราะห์ของเราต่อยอดจากผลการค้นพบนี้โดยการเปิดเผยระดับโปรตีนที่หลั่งออกมาภายนอกเซลล์ที่เกี่ยวข้องกับความเครียด เช่น แอนเน็กซิน ซึ่งเกี่ยวข้องกับกลไกการซ่อมแซมซาร์โคเลมมาในเส้นใยกล้ามเนื้อจากผู้ป่วยโรคกล้ามเนื้ออ่อนแรงชนิดเนมาไลน์ ACTA1 และ TNNT1^57,58,59 โดยสรุป ระดับแอนเน็กซินที่เพิ่มขึ้นในเส้นใยกล้ามเนื้อจากผู้ป่วยโรคกล้ามเนื้ออ่อนแรงชนิดเนมาไลน์อาจแสดงถึงการตอบสนองของเซลล์เพื่อซ่อมแซมเส้นใยกล้ามเนื้อที่ฝ่อลีบอย่างรุนแรง
แม้ว่าการศึกษานี้จะเป็นการวิเคราะห์โอไมซ์ของกล้ามเนื้อทั้งมัดระดับเส้นใยเดี่ยวที่ใหญ่ที่สุดในมนุษย์เท่าที่เคยมีมา แต่ก็ยังมีข้อจำกัดอยู่บ้าง เราแยกเส้นใยกล้ามเนื้อโครงร่างจากกลุ่มตัวอย่างผู้เข้าร่วมที่มีขนาดค่อนข้างเล็กและเป็นเนื้อเดียวกัน และจากกล้ามเนื้อเพียงมัดเดียว (กล้ามเนื้อ vastus lateralis) ดังนั้นจึงเป็นไปไม่ได้ที่จะตัดความเป็นไปได้ของการมีอยู่ของประชากรเส้นใยเฉพาะกลุ่มในกล้ามเนื้อประเภทต่างๆ และในสภาวะทางสรีรวิทยาของกล้ามเนื้อที่แตกต่างกันอย่างมาก ตัวอย่างเช่น เราไม่สามารถตัดความเป็นไปได้ที่เส้นใยที่เร็วมาก (เช่น เส้นใย 2X บริสุทธิ์) จะปรากฏขึ้นในนักวิ่งระยะสั้นและ/หรือนักกีฬายกน้ำหนักที่ได้รับการฝึกฝนมาอย่างดี79 หรือในช่วงที่กล้ามเนื้อไม่ได้ใช้งาน66,80 นอกจากนี้ ขนาดตัวอย่างผู้เข้าร่วมที่จำกัดยังทำให้เราไม่สามารถตรวจสอบความแตกต่างทางเพศในความหลากหลายของเส้นใยได้ เนื่องจากอัตราส่วนของประเภทเส้นใยเป็นที่ทราบกันดีว่าแตกต่างกันระหว่างชายและหญิง ยิ่งไปกว่านั้น เราไม่สามารถทำการวิเคราะห์ทรานสคริปโตมิกและโปรตีโอมิกในเส้นใยกล้ามเนื้อเดียวกันหรือตัวอย่างจากผู้เข้าร่วมคนเดียวกันได้ ในขณะที่เราและผู้อื่นยังคงพัฒนาการวิเคราะห์เซลล์เดี่ยวและเส้นใยกล้ามเนื้อเดี่ยวโดยใช้การวิเคราะห์แบบโอมิกส์เพื่อให้ได้ปริมาณตัวอย่างที่ต่ำมาก (ดังที่แสดงให้เห็นในที่นี้ในการวิเคราะห์เส้นใยจากผู้ป่วยที่เป็นโรคกล้ามเนื้ออ่อนแรงจากความผิดปกติของไมโทคอนเดรีย) โอกาสในการผสมผสานวิธีการวิเคราะห์แบบโอมิกส์หลายมิติ (และเชิงฟังก์ชัน) ภายในเส้นใยกล้ามเนื้อเดี่ยวก็เริ่มปรากฏชัดเจนขึ้น
โดยรวมแล้ว ข้อมูลของเราได้ระบุและอธิบายกลไกการถอดรหัสและการเปลี่ยนแปลงหลังการถอดรหัสที่ส่งผลต่อความหลากหลายของกล้ามเนื้อโครงร่าง โดยเฉพาะอย่างยิ่ง เราได้นำเสนอข้อมูลที่ท้าทายความเชื่อดั้งเดิมในสรีรวิทยาของกล้ามเนื้อโครงร่างที่เกี่ยวข้องกับคำจำกัดความของชนิดเส้นใยตาม MYH แบบดั้งเดิม เราหวังที่จะจุดประกายการถกเถียงและท้ายที่สุดก็คือการทบทวนความเข้าใจของเราเกี่ยวกับการจำแนกประเภทและความหลากหลายของเส้นใยกล้ามเนื้อโครงร่าง
ผู้เข้าร่วมชาวคอเคเชียนจำนวน 14 คน (ชาย 12 คน และหญิง 2 คน) สมัครใจเข้าร่วมการศึกษาครั้งนี้ การศึกษาได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการจริยธรรมของโรงพยาบาลมหาวิทยาลัยเกนต์ (BC-10237) ปฏิบัติตามปฏิญญาเฮลซิงกิปี 2013 และลงทะเบียนไว้ที่ ClinicalTrials.gov (NCT05131555) ลักษณะทั่วไปของผู้เข้าร่วมแสดงอยู่ในตารางเสริม 1 หลังจากได้รับความยินยอมโดยวาจาและเป็นลายลักษณ์อักษรแล้ว ผู้เข้าร่วมได้รับการตรวจร่างกายก่อนที่จะได้รับการคัดเลือกเข้าร่วมการศึกษาอย่างเป็นทางการ ผู้เข้าร่วมมีอายุยังน้อย (22–42 ปี) มีสุขภาพดี (ไม่มีโรคประจำตัว ไม่มีประวัติการสูบบุหรี่) และมีกิจกรรมทางกายปานกลาง การวัดปริมาณการใช้ออกซิเจนสูงสุดทำได้โดยใช้เครื่องวัดการก้าวเดินเพื่อประเมินสมรรถภาพทางกายตามที่ได้อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ 81
ตัวอย่างชิ้นเนื้อกล้ามเนื้อถูกเก็บรวบรวมในขณะพักและในขณะอดอาหารจำนวน 3 ครั้ง โดยเว้นระยะห่าง 14 วัน เนื่องจากตัวอย่างเหล่านี้ถูกเก็บรวบรวมเป็นส่วนหนึ่งของการศึกษาที่ใหญ่กว่า ผู้เข้าร่วมจึงรับประทานยาหลอก (แลคโตส) สารต้านตัวรับ H1 (เฟกโซเฟนาดีน 540 มก.) หรือสารต้านตัวรับ H2 (ฟาโมทิดีน 40 มก.) 40 นาทีก่อนการเก็บตัวอย่างชิ้นเนื้อ เราได้แสดงให้เห็นก่อนหน้านี้แล้วว่าสารต้านตัวรับฮิสตามีนเหล่านี้ไม่มีผลต่อความแข็งแรงของกล้ามเนื้อโครงร่างในขณะพัก81 และไม่พบการจัดกลุ่มที่เกี่ยวข้องกับสถานะในแผนภูมิควบคุมคุณภาพของเรา (ภาพประกอบเพิ่มเติมที่ 3 และ 6) ผู้เข้าร่วมรับประทานอาหารมาตรฐาน (41.4 กิโลแคลอรี/กิโลกรัมน้ำหนักตัว คาร์โบไฮเดรต 5.1 กรัม/กิโลกรัมน้ำหนักตัว โปรตีน 1.4 กรัม/กิโลกรัมน้ำหนักตัว และไขมัน 1.6 กรัม/กิโลกรัมน้ำหนักตัว) เป็นเวลา 48 ชั่วโมงก่อนวันทำการทดลองแต่ละวัน และรับประทานอาหารเช้ามาตรฐาน (คาร์โบไฮเดรต 1.5 กรัม/กิโลกรัมน้ำหนักตัว) ในตอนเช้าของวันทำการทดลอง ภายใต้การใช้ยาชาเฉพาะที่ (ลิโดเคน 1% 0.5 มล. โดยไม่มีอะดรีนาลิน) ได้ทำการเก็บตัวอย่างเนื้อเยื่อกล้ามเนื้อจากกล้ามเนื้อ vastus lateralis โดยใช้การเจาะดูดแบบ Bergström ผ่านผิวหนัง82 ตัวอย่างกล้ามเนื้อจะถูกฝังใน RNAlater ทันทีและเก็บไว้ที่อุณหภูมิ 4°C จนกว่าจะทำการแยกเส้นใยด้วยมือ (นานถึง 3 วัน)
กลุ่มเส้นใยกล้ามเนื้อที่แยกออกมาใหม่จะถูกย้ายไปยังอาหารเลี้ยงเซลล์ RNAlater สดในจานเพาะเลี้ยง จากนั้นจึงทำการแยกเส้นใยกล้ามเนื้อแต่ละเส้นด้วยมือโดยใช้กล้องจุลทรรศน์สเตอริโอและแหนบขนาดเล็ก โดยทำการแยกเส้นใย 25 เส้นจากชิ้นเนื้อแต่ละชิ้น โดยให้ความสำคัญเป็นพิเศษกับการเลือกเส้นใยจากบริเวณต่างๆ ของชิ้นเนื้อ หลังจากแยกเส้นใยแล้ว เส้นใยแต่ละเส้นจะถูกแช่เบาๆ ในบัฟเฟอร์สำหรับสลายเซลล์ (SingleShot Cell Lysis Kit, Bio-Rad) ปริมาณ 3 ไมโครลิตร ซึ่งประกอบด้วยเอนไซม์โปรตีเนส เค และดีเอ็นเอส เพื่อกำจัดโปรตีนและดีเอ็นเอที่ไม่ต้องการ จากนั้นจึงเริ่มกระบวนการสลายเซลล์และกำจัดโปรตีน/ดีเอ็นเอโดยการเขย่าเบาๆ ปั่นของเหลวในเครื่องปั่นเหวี่ยงขนาดเล็ก และบ่มที่อุณหภูมิห้อง (10 นาที) จากนั้นนำสารละลายไปบ่มในเครื่องควบคุมอุณหภูมิ (T100, Bio-Rad) ที่อุณหภูมิ 37°C เป็นเวลา 5 นาที 75°C เป็นเวลา 5 นาที แล้วเก็บรักษาไว้ที่ -80°C ทันทีจนกว่าจะดำเนินการต่อไป
เตรียมไลบรารี RNA ที่มีปลายโพลีอะดีนิเลตซึ่งเข้ากันได้กับ Illumina จากสารละลายไลเซตของเส้นใยกล้ามเนื้อ 2 ไมโครลิตร โดยใช้ชุดอุปกรณ์ QuantSeq-Pool 3′ mRNA-Seq Library Prep Kit (Lexogen) สามารถดูวิธีการโดยละเอียดได้ในคู่มือของผู้ผลิต กระบวนการเริ่มต้นด้วยการสังเคราะห์ cDNA สายแรกโดยการถอดรหัสย้อนกลับ ซึ่งในระหว่างนั้นจะมีการใส่ตัวระบุโมเลกุลเฉพาะ (UMIs) และบาร์โค้ด i1 เฉพาะตัวอย่าง เพื่อให้แน่ใจว่ามีการรวมตัวอย่างและลดความแปรปรวนทางเทคนิคในระหว่างกระบวนการขั้นต่อไป จากนั้น cDNA จากเส้นใยกล้ามเนื้อ 96 เส้นจะถูกรวมเข้าด้วยกันและทำให้บริสุทธิ์ด้วยลูกปัดแม่เหล็ก หลังจากนั้นจะกำจัด RNA ออกและทำการสังเคราะห์สายที่สองโดยใช้ไพรเมอร์แบบสุ่ม ไลบรารีจะถูกทำให้บริสุทธิ์ด้วยลูกปัดแม่เหล็ก เพิ่มแท็ก i5/i7 เฉพาะกลุ่ม และขยายด้วย PCR ขั้นตอนการทำให้บริสุทธิ์ขั้นสุดท้ายจะสร้างไลบรารีที่เข้ากันได้กับ Illumina คุณภาพของกลุ่มตัวอย่างแต่ละกลุ่มได้รับการประเมินโดยใช้ชุดวิเคราะห์ดีเอ็นเอขนาดเล็กที่มีความไวสูง (High Sensitivity Small Fragment DNA Analysis Kit, Agilent Technologies, DNF-477-0500)
จากการวัดปริมาณด้วย Qubit ทำให้สามารถรวมกลุ่มตัวอย่างเพิ่มเติมได้ในความเข้มข้นที่เท่ากัน (2 nM) จากนั้นจึงนำกลุ่มตัวอย่างที่ได้ไปทำการลำดับดีเอ็นเอด้วยเครื่อง NovaSeq 6000 ในโหมดมาตรฐาน โดยใช้ชุดน้ำยา NovaSeq S2 Reagent Kit (1 × 100 นิวคลีโอไทด์) ที่ความเข้มข้น 2 nM (4% PhiX)
ขั้นตอนการประมวลผลข้อมูลของเราอิงตามขั้นตอนการวิเคราะห์ข้อมูล QuantSeq Pool ของ Lexogen (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis) ขั้นแรก ข้อมูลจะถูกแยกกลุ่มด้วย bcl2fastq2 (v2.20.0) โดยใช้ดัชนี i7/i5 จากนั้น อ่านที่ 2 จะถูกแยกกลุ่มด้วย idemux (v0.1.6) โดยใช้บาร์โค้ดตัวอย่าง i1 และลำดับ UMI จะถูกดึงออกมาด้วย umi_tools (v1.0.1) จากนั้น อ่านจะถูกตัดแต่งด้วย cutadapt (v3.4) หลายรอบเพื่อลบอ่านสั้นๆ (<20) หรืออ่านที่ประกอบด้วยลำดับอะแดปเตอร์เพียงอย่างเดียว จากนั้น อ่านจะถูกจัดเรียงกับจีโนมมนุษย์โดยใช้ STAR (v2.6.0c) และไฟล์ BAM จะถูกจัดทำดัชนีด้วย SAMtools (v1.11) อ่านที่ซ้ำกันจะถูกลบออกโดยใช้ umi_tools (v1.0.1) สุดท้ายนี้ ได้ทำการนับจำนวนการจัดเรียงลำดับโดยใช้ featureCounts ใน Subread (v2.0.3) และได้ทำการควบคุมคุณภาพโดยใช้ FastQC (v0.11.9) ในขั้นตอนกลางต่างๆ ของไปป์ไลน์
การประมวลผลและการแสดงภาพข้อมูลชีวสารสนเทศเพิ่มเติมทั้งหมดดำเนินการใน R (v4.2.3) โดยใช้เวิร์กโฟลว์ Seurat (v4.4.0) เป็นหลัก 83 ดังนั้น ค่า UMI แต่ละรายการและเมทริกซ์เมตาเดตาจึงถูกแปลงเป็นออบเจ็กต์ Seurat ยีนที่แสดงออกในเส้นใยน้อยกว่า 30% ของเส้นใยทั้งหมดถูกลบออก ตัวอย่างคุณภาพต่ำถูกลบออกโดยพิจารณาจากเกณฑ์ขั้นต่ำ 1000 ค่า UMI และ 1000 ยีนที่ตรวจพบ ในที่สุด เส้นใย 925 เส้นผ่านขั้นตอนการกรองควบคุมคุณภาพทั้งหมด ค่า UMI ถูกทำให้เป็นมาตรฐานโดยใช้วิธี Seurat SCTransform v2 84 ซึ่งรวมถึงคุณลักษณะที่ตรวจพบทั้งหมด 7418 รายการ และความแตกต่างระหว่างผู้เข้าร่วมถูกลบออก เมตาเดตาที่เกี่ยวข้องทั้งหมดสามารถพบได้ในชุดข้อมูลเสริม 28