ขอขอบคุณที่เยี่ยมชม Nature.com เวอร์ชันเบราว์เซอร์ที่คุณใช้มีการรองรับ CSS อย่างจำกัด เพื่อผลลัพธ์ที่ดีที่สุด เราขอแนะนำให้ใช้เบราว์เซอร์รุ่นใหม่ (หรือปิดใช้งานโหมดความเข้ากันได้ใน Internet Explorer) ในระหว่างนี้ เพื่อให้มั่นใจว่าได้รับการสนับสนุนอย่างต่อเนื่อง เราจะแสดงไซต์โดยไม่มีสไตล์และ JavaScript
การสร้างแบบจำลองสัตว์ของการเปลี่ยนแปลงโมดิก (MC) ถือเป็นพื้นฐานสำคัญในการศึกษา MC กระต่ายขาวนิวซีแลนด์จำนวน 54 ตัวถูกแบ่งออกเป็นกลุ่มการผ่าตัดหลอก กลุ่มการปลูกถ่ายกล้ามเนื้อ (กลุ่ม ME) และกลุ่มการปลูกถ่ายนิวเคลียสพัลโพซัส (กลุ่ม NPE) ในกลุ่ม NPE แผ่นกระดูกสันหลังถูกเปิดออกโดยวิธีการผ่าตัดกระดูกสันหลังส่วนเอว และใช้เข็มเจาะกระดูกสันหลัง L5 ใกล้กับแผ่นปลาย NP ถูกดึงออกจากหมอนรองกระดูกสันหลัง L1/2 ด้วยเข็มฉีดยาแล้วฉีดเข้าไป เจาะรูในกระดูกใต้ผิวหนัง ขั้นตอนการผ่าตัดและวิธีการเจาะในกลุ่มการปลูกถ่ายกล้ามเนื้อและกลุ่มการผ่าตัดเสแสร้งเหมือนกับกลุ่มการปลูกถ่าย NP ในกลุ่ม ME นั้น กล้ามเนื้อชิ้นหนึ่งถูกใส่เข้าไปในรู ในขณะที่ในกลุ่มการผ่าตัดเสแสร้งนั้น ไม่มีอะไรถูกใส่เข้าไปในหลุม หลังการผ่าตัด จะทำการสแกน MRI และทดสอบอณูชีววิทยา สัญญาณในกลุ่ม NPE เปลี่ยนไป แต่ไม่มีการเปลี่ยนแปลงสัญญาณที่ชัดเจนในกลุ่มปฏิบัติการหลอกลวงและกลุ่ม ME การสังเกตทางจุลพยาธิวิทยาแสดงให้เห็นว่าการแพร่กระจายของเนื้อเยื่อผิดปกติถูกสังเกตที่บริเวณการปลูกถ่าย และการแสดงออกของ IL-4, IL-17 และ IFN-γ เพิ่มขึ้นในกลุ่ม NPE การฝัง NP เข้าไปในกระดูกใต้กระดูกสามารถทำให้เกิดแบบจำลองสัตว์ของ MC ได้
การเปลี่ยนแปลงแบบโมดิก (MC) คือรอยโรคที่แผ่นปิดกระดูกสันหลังและไขกระดูกที่อยู่ติดกันซึ่งมองเห็นได้จากการถ่ายภาพด้วยคลื่นสนามแม่เหล็ก (MRI) พบได้บ่อยในผู้ที่มีอาการร่วม1. การศึกษาจำนวนมากได้เน้นย้ำถึงความสำคัญของ MC เนื่องจากมีความเกี่ยวข้องกับอาการปวดหลังส่วนล่าง (LBP)2,3 de Roos และคณะ 4 และ Modic และคณะ 5 ได้อธิบายความผิดปกติของสัญญาณ subchondral สามประเภทที่แตกต่างกันในไขกระดูกกระดูกสันหลังเป็นครั้งแรก การเปลี่ยนแปลงแบบ Modic I นั้นเป็นแบบไฮโปอินเทนส์ในลำดับ T1-weighted (T1W) และไฮเปอร์อินเทนส์ในลำดับ T2-weighted (T2W) รอยโรคนี้เผยให้เห็นแผ่นปลายรอยแยกและเนื้อเยื่อเม็ดหลอดเลือดที่อยู่ติดกันในไขกระดูก การเปลี่ยนแปลง Modic type II แสดงสัญญาณสูงทั้งในลำดับ T1W และ T2W ในรอยโรคประเภทนี้ อาจพบการทำลายแผ่นปิดท้ายได้ เช่นเดียวกับการเปลี่ยนไขมันทางเนื้อเยื่อวิทยาของไขกระดูกที่อยู่ติดกัน การเปลี่ยนแปลง Modic ประเภท III แสดงสัญญาณต่ำในลำดับ T1W และ T2W มีการสังเกตรอยโรค Sclerotic ที่สัมพันธ์กับแผ่นปิดท้าย6 MC ถือเป็นโรคทางพยาธิวิทยาของกระดูกสันหลังและมีความเกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับโรคความเสื่อมของกระดูกสันหลังหลายชนิด7,8,9
เมื่อพิจารณาข้อมูลที่มีอยู่ การศึกษาหลายชิ้นได้ให้ข้อมูลเชิงลึกโดยละเอียดเกี่ยวกับสาเหตุและกลไกทางพยาธิวิทยาของ MC อัลเบิร์ตและคณะ แนะนำว่า MC อาจเกิดจากหมอนรองกระดูกสันหลัง 8 หูและคณะ ถือว่า MC เกิดการเสื่อมของแผ่นดิสก์อย่างรุนแรง Kroc เสนอแนวคิดเรื่อง "การแตกของหมอนรองกระดูกภายใน" ซึ่งระบุว่าการบาดเจ็บของหมอนรองกระดูกซ้ำๆ อาจนำไปสู่การฉีกขาดขนาดเล็กที่แผ่นปิดด้านท้าย หลังจากเกิดรอยแหว่ง การทำลายแผ่นปิดส่วนปลายโดยนิวเคลียสพัลโพซัส (NP) อาจกระตุ้นให้เกิดการตอบสนองของภูมิต้านตนเอง ซึ่งนำไปสู่การพัฒนาของ MC11 ต่อไป แม่และคณะ แบ่งปันมุมมองที่คล้ายกันและรายงานว่าภูมิต้านทานตนเองที่เกิดจาก NP มีบทบาทสำคัญในการเกิดโรคของ MC12
เซลล์ของระบบภูมิคุ้มกัน โดยเฉพาะอย่างยิ่งเซลล์เม็ดเลือดขาวตัวช่วย CD4+ T มีบทบาทสำคัญในการเกิดโรคของภูมิต้านทานตนเอง ชุดย่อย Th17 ที่ถูกค้นพบเมื่อเร็วๆ นี้ผลิตไซโตไคน์ที่ทำให้เกิดการอักเสบ IL-17 ส่งเสริมการแสดงออกของเคมีบำบัด และกระตุ้นทีเซลล์ในอวัยวะที่เสียหายให้ผลิต IFN-γ14 เซลล์ Th2 ยังมีบทบาทพิเศษในการเกิดโรคของการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกัน การแสดงออกของ IL-4 ในฐานะเซลล์ Th2 ที่เป็นตัวแทนสามารถนำไปสู่ผลกระทบทางภูมิคุ้มกันบกพร่องอย่างรุนแรง
แม้ว่าการศึกษาทางคลินิกจำนวนมากได้ดำเนินการกับ MC16,17,18,19,20,21,22,23,24 แล้ว แต่ก็ยังขาดแบบจำลองการทดลองในสัตว์ที่เหมาะสมที่สามารถเลียนแบบกระบวนการ MC ที่เกิดขึ้นบ่อยครั้งในมนุษย์และสามารถ ใช้ในการตรวจสอบสาเหตุหรือการรักษาใหม่ๆ เช่น การบำบัดแบบกำหนดเป้าหมาย จนถึงปัจจุบัน มีรายงานแบบจำลองสัตว์ของ MC เพียงไม่กี่ตัวเท่านั้นเพื่อศึกษากลไกทางพยาธิวิทยาที่ซ่อนอยู่
จากทฤษฎีภูมิต้านตนเองที่เสนอโดย Albert และ Ma การศึกษานี้ได้สร้างแบบจำลอง MC กระต่ายที่เรียบง่ายและทำซ้ำได้โดยการปลูกถ่าย NP อัตโนมัติใกล้กับแผ่นปลายกระดูกสันหลังที่เจาะ วัตถุประสงค์อื่นๆ คือการสังเกตลักษณะทางเนื้อเยื่อวิทยาของแบบจำลองสัตว์ และประเมินกลไกเฉพาะของ NP ในการพัฒนา MC ด้วยเหตุนี้ เราใช้เทคนิคต่างๆ เช่น อณูชีววิทยา MRI และการศึกษาทางเนื้อเยื่อวิทยาเพื่อศึกษาความก้าวหน้าของ MC
กระต่าย 2 ตัวเสียชีวิตจากการตกเลือดระหว่างการผ่าตัด และกระต่าย 4 ตัวเสียชีวิตระหว่างการดมยาสลบในระหว่างการทำ MRI กระต่ายที่เหลืออีก 48 ตัวรอดชีวิตและไม่แสดงอาการทางพฤติกรรมหรือระบบประสาทหลังการผ่าตัด
MRI แสดงให้เห็นว่าความเข้มของสัญญาณของเนื้อเยื่อที่ฝังอยู่ในรูต่างๆ นั้นแตกต่างกัน ความเข้มของสัญญาณของกระดูกสันหลัง L5 ในกลุ่ม NPE จะค่อยๆ เปลี่ยนไปที่ 12, 16 และ 20 สัปดาห์หลังจากการแทรก (ลำดับ T1W แสดงสัญญาณต่ำ และลำดับ T2W แสดงสัญญาณผสมบวกสัญญาณต่ำ) (รูปที่ 1C) ในขณะที่ปรากฏ MRI ของชิ้นส่วนฝังอีกสองกลุ่มยังคงค่อนข้างคงที่ในช่วงเวลาเดียวกัน (รูปที่ 1A, B)
( A ) MRI ตามลำดับที่เป็นตัวแทนของกระดูกสันหลังส่วนเอวของกระต่ายที่จุดเวลา 3 จุด ไม่พบสัญญาณผิดปกติในภาพของกลุ่มปฏิบัติการหลอกลวง (B) ลักษณะสัญญาณของกระดูกสันหลังในกลุ่ม ME นั้นคล้ายคลึงกับลักษณะสัญญาณในกลุ่มปฏิบัติการเสแสร้ง และไม่พบการเปลี่ยนแปลงสัญญาณที่มีนัยสำคัญที่ไซต์ฝังเมื่อเวลาผ่านไป (C) ในกลุ่ม NPE สัญญาณต่ำจะมองเห็นได้ชัดเจนในลำดับ T1W และสัญญาณผสมและสัญญาณต่ำจะมองเห็นได้ชัดเจนในลำดับ T2W จากช่วง 12 สัปดาห์ถึงช่วง 20 สัปดาห์ สัญญาณสูงประปรายที่อยู่รอบสัญญาณต่ำในลำดับ T2W จะลดลง
ภาวะกระดูกเกินอย่างเห็นได้ชัดสามารถเห็นได้ที่บริเวณการฝังตัวของกระดูกสันหลังในกลุ่ม NPE และภาวะกระดูกเกินเกิดขึ้นเร็วกว่าจาก 12 ถึง 20 สัปดาห์ (รูปที่ 2C) เมื่อเทียบกับกลุ่ม NPE ไม่พบการเปลี่ยนแปลงที่มีนัยสำคัญในกระดูกสันหลังแบบจำลอง ร่างกาย; กลุ่มเสแสร้งและกลุ่ม ME (รูปที่ 2C) 2A,B)
(A) พื้นผิวของกระดูกสันหลังบริเวณส่วนที่ฝังเรียบมาก รูสามารถสมานตัวได้ดี และไม่มีภาวะ hyperplasia ในร่างกายกระดูกสันหลัง (B) รูปร่างของตำแหน่งที่ปลูกถ่ายในกลุ่ม ME นั้นคล้ายคลึงกับรูปร่างของกลุ่มการผ่าตัดหลอก และไม่มีการเปลี่ยนแปลงที่ชัดเจนในรูปลักษณ์ของตำแหน่งที่ปลูกถ่ายเมื่อเวลาผ่านไป (C) ภาวะกระดูกพรุนเกิดขึ้นที่บริเวณที่ปลูกถ่ายในกลุ่ม NPE ภาวะกระดูกพรุนเพิ่มขึ้นอย่างรวดเร็วและขยายออกไปผ่านหมอนรองกระดูกสันหลังไปยังกระดูกสันหลังด้านตรงข้าม
การวิเคราะห์ทางจุลพยาธิวิทยาให้ข้อมูลโดยละเอียดเพิ่มเติมเกี่ยวกับการสร้างกระดูก รูปที่ 3 แสดงภาพถ่ายของส่วนหลังการผ่าตัดที่เปื้อนด้วย H&E ในกลุ่มปฏิบัติการหลอกลวง chondrocytes ถูกจัดเรียงอย่างดีและตรวจไม่พบการเพิ่มจำนวนเซลล์ (รูปที่ 3A) สถานการณ์ในกลุ่ม ME นั้นคล้ายคลึงกับสถานการณ์ในกลุ่มปฏิบัติการหลอกลวง (รูปที่ 3B) อย่างไรก็ตามในกลุ่ม NPE พบ chondrocytes จำนวนมากและการแพร่กระจายของเซลล์ที่มีลักษณะคล้าย NP ที่บริเวณการปลูกถ่าย (รูปที่ 3C);
(A) Trabeculae สามารถมองเห็นได้ใกล้กับแผ่นปลาย chondrocytes ถูกจัดเรียงอย่างเรียบร้อยโดยมีขนาดและรูปร่างของเซลล์สม่ำเสมอและไม่มีการแพร่กระจาย (40 ครั้ง) (B) สภาพของตำแหน่งการฝังในกลุ่ม ME คล้ายกับสภาพของกลุ่มเสแสร้ง Trabeculae และ chondrocytes สามารถมองเห็นได้ แต่ไม่มีการแพร่กระจายที่ชัดเจนในบริเวณที่ปลูกถ่าย (40 ครั้ง) (B) จะเห็นได้ว่าคอนโดรไซต์และเซลล์คล้าย NP ขยายตัวอย่างมีนัยสำคัญ และรูปร่างและขนาดของคอนโดรไซต์ไม่เท่ากัน (40 ครั้ง)
การแสดงออกของ mRNA ของ interleukin 4 (IL-4), mRNA ของ interleukin 17 (IL-17) และ mRNA ของ interferon γ (IFN-γ) ถูกสังเกตพบในทั้งกลุ่ม NPE และ ME เมื่อเปรียบเทียบระดับการแสดงออกของยีนเป้าหมาย การแสดงออกของยีนของ IL-4, IL-17 และ IFN-γ เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในกลุ่ม NPE เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่ม ME และกลุ่มปฏิบัติการหลอกลวง (รูปที่ 4) (พี < 0.05) เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มปฏิบัติการเสแสร้ง ระดับการแสดงออกของ IL-4, IL-17 และ IFN-γ ในกลุ่ม ME เพิ่มขึ้นเพียงเล็กน้อยและไม่ถึงการเปลี่ยนแปลงทางสถิติ (P > 0.05)
การแสดงออกของ mRNA ของ IL-4, IL-17 และ IFN-γ ในกลุ่ม NPE แสดงแนวโน้มที่สูงกว่ากลุ่มปฏิบัติการเสแสร้งและกลุ่ม ME อย่างมีนัยสำคัญ (P <0.05)
ในทางตรงกันข้าม ระดับการแสดงออกในกลุ่ม ME ไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญ (P>0.05)
การวิเคราะห์เวสเทิร์นบล็อตถูกดำเนินการโดยใช้แอนติบอดีที่มีวางจำหน่ายทั่วไปที่ต้าน IL-4 และ IL-17 เพื่อยืนยันรูปแบบการแสดงออก mRNA ที่ถูกเปลี่ยนแปลง ดังที่แสดงในรูปที่ 5A, B เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่ม ME และกลุ่มปฏิบัติการเสแสร้ง ระดับโปรตีนของ IL-4 และ IL-17 ในกลุ่ม NPE เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ (P <0.05) เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มปฏิบัติการเสแสร้ง ระดับโปรตีนของ IL-4 และ IL-17 ในกลุ่ม ME ก็ล้มเหลวในการเข้าถึงการเปลี่ยนแปลงที่มีนัยสำคัญทางสถิติ (P> 0.05)
(A) ระดับโปรตีนของ IL-4 และ IL-17 ในกลุ่ม NPE สูงกว่ากลุ่ม ME และกลุ่มยาหลอกอย่างมีนัยสำคัญ (P <0.05) (B) ฮิสโตแกรมแบบ Western blot
เนื่องจากตัวอย่างจากมนุษย์ที่ได้รับในระหว่างการผ่าตัดมีจำนวนจำกัด การศึกษาที่ชัดเจนและละเอียดเกี่ยวกับการเกิดโรคของ MC จึงค่อนข้างยาก เราพยายามสร้างแบบจำลองสัตว์ของ MC เพื่อศึกษากลไกทางพยาธิวิทยาที่อาจเกิดขึ้น ในเวลาเดียวกัน การประเมินทางรังสีวิทยา การประเมินทางเนื้อเยื่อวิทยา และการประเมินทางอณูชีววิทยาถูกนำมาใช้เพื่อติดตามวิถีของ MC ที่เกิดจากการปลูกถ่าย NP อัตโนมัติ เป็นผลให้ แบบจำลองการปลูกถ่าย NP ส่งผลให้เกิดการเปลี่ยนแปลงอย่างค่อยเป็นค่อยไปในความเข้มของสัญญาณจากจุดเวลา 12 สัปดาห์เป็น 20 สัปดาห์ (สัญญาณต่ำแบบผสมในลำดับ T1W และสัญญาณต่ำในลำดับ T2W) ซึ่งบ่งชี้การเปลี่ยนแปลงของเนื้อเยื่อ และเนื้อเยื่อวิทยาและโมเลกุล การประเมินทางชีววิทยายืนยันผลการศึกษาทางรังสีวิทยา
ผลการทดลองนี้แสดงให้เห็นว่าการเปลี่ยนแปลงทางการมองเห็นและเนื้อเยื่อเกิดขึ้นในบริเวณที่มีการละเมิดกระดูกสันหลังในกลุ่ม NPE ในเวลาเดียวกัน การแสดงออกของยีน IL-4, IL-17 และ IFN-γ เช่นเดียวกับ IL-4, IL-17 และ IFN-γ ถูกสังเกต ซึ่งบ่งชี้ว่ามีการละเมิดเนื้อเยื่อ pulposus นิวเคลียส autologous ในกระดูกสันหลัง ร่างกายอาจทำให้เกิดสัญญาณและการเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยาหลายชุด สังเกตได้ง่ายว่าลักษณะสัญญาณของกระดูกสันหลังในแบบจำลองสัตว์ (สัญญาณต่ำในลำดับ T1W, สัญญาณผสมและสัญญาณต่ำในลำดับ T2W) มีความคล้ายคลึงกับลักษณะเซลล์กระดูกสันหลังของมนุษย์อย่างมาก และคุณลักษณะของ MRI ก็เช่นกัน ยืนยันการสังเกตของเนื้อเยื่อวิทยาและกายวิภาคศาสตร์ขั้นต้นนั่นคือการเปลี่ยนแปลงของเซลล์กระดูกสันหลังมีความก้าวหน้า แม้ว่าการตอบสนองต่อการอักเสบที่เกิดจากการบาดเจ็บเฉียบพลันอาจปรากฏขึ้นไม่นานหลังการเจาะ แต่ผล MRI แสดงให้เห็นว่าการเปลี่ยนแปลงสัญญาณที่เพิ่มขึ้นอย่างต่อเนื่องปรากฏขึ้น 12 สัปดาห์หลังการเจาะ และคงอยู่นานถึง 20 สัปดาห์โดยไม่มีสัญญาณของการฟื้นตัวหรือการกลับรายการของการเปลี่ยนแปลงของ MRI ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า NP กระดูกสันหลังแบบ autologous เป็นวิธีที่เชื่อถือได้ในการสร้าง MV แบบก้าวหน้าในกระต่าย
การเจาะแบบนี้ต้องใช้ทักษะ เวลา และความพยายามในการผ่าตัดที่เพียงพอ ในการทดลองเบื้องต้น การผ่าหรือกระตุ้นโครงสร้างเอ็นพารากระดูกสันหลังมากเกินไปอาจส่งผลให้เกิดการก่อตัวของกระดูกกระดูกกระดูกสันหลัง ควรระมัดระวังไม่ให้แผ่นดิสก์ที่อยู่ติดกันเสียหายหรือระคายเคือง เนื่องจากต้องควบคุมความลึกของการเจาะเพื่อให้ได้ผลลัพธ์ที่สม่ำเสมอและทำซ้ำได้ เราจึงสร้างปลั๊กด้วยตนเองโดยการตัดปลอกเข็มยาว 3 มม. ออก การใช้ปลั๊กนี้ช่วยให้มั่นใจได้ถึงความลึกของการเจาะที่สม่ำเสมอในร่างกายกระดูกสันหลัง ในการทดลองเบื้องต้น ศัลยแพทย์กระดูกและข้อ 3 คนที่เกี่ยวข้องในการผ่าตัดพบว่าการใช้เข็มขนาด 16 เกจใช้งานได้ง่ายกว่าเข็มขนาด 18 เกจหรือวิธีการอื่นๆ เพื่อป้องกันไม่ให้เลือดออกมากเกินไประหว่างการเจาะ การถือเข็มไว้ครู่หนึ่งจะทำให้มีรูสอดที่เหมาะสมกว่า ซึ่งบ่งบอกว่าสามารถควบคุม MC ได้ในระดับหนึ่งด้วยวิธีนี้
แม้ว่าการศึกษาจำนวนมากมีเป้าหมายที่ MC แต่ยังไม่ค่อยมีใครรู้เกี่ยวกับสาเหตุและการเกิดโรคของ MC25,26,27 จากการศึกษาก่อนหน้าของเรา เราพบว่าภูมิต้านทานตนเองมีบทบาทสำคัญในการเกิดขึ้นและการพัฒนาของ MC12 การศึกษานี้ตรวจสอบการแสดงออกเชิงปริมาณของ IL-4, IL-17 และ IFN-γ ซึ่งเป็นวิถีทางหลักในการสร้างความแตกต่างของเซลล์ CD4+ หลังการกระตุ้นแอนติเจน ในการศึกษาของเรา เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มเชิงลบ กลุ่ม NPE มีการแสดงออกของ IL-4, IL-17 และ IFN-γ ที่สูงขึ้น และระดับโปรตีนของ IL-4 และ IL-17 ก็สูงกว่าเช่นกัน
ในทางการแพทย์ การแสดงออกของ IL-17 mRNA จะเพิ่มขึ้นในเซลล์ NP จากผู้ป่วยที่มีหมอนรอง ระดับการแสดงออกของ IL-4 และ IFN-γ ที่เพิ่มขึ้นยังพบได้ในแบบจำลองหมอนรองกระดูกสันหลังแบบไม่มีการบีบอัดแบบเฉียบพลัน เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุมที่มีสุขภาพดี IL-17 มีบทบาทสำคัญในการอักเสบ การบาดเจ็บของเนื้อเยื่อในโรคแพ้ภูมิตนเอง30 และช่วยเพิ่มการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันต่อ IFN-γ31 มีรายงานการบาดเจ็บของเนื้อเยื่อที่ใช้สื่อกลาง IL-17 ที่ได้รับการปรับปรุงในหนู MRL / lpr และหนูที่ไวต่อภูมิต้านทานผิดปกติ IL-4 สามารถยับยั้งการแสดงออกของไซโตไคน์ที่ทำให้เกิดการอักเสบ (เช่น IL-1βและTNFα) และการกระตุ้นแมคโครฟาจ มีรายงานว่าการแสดงออกของ mRNA ของ IL-4 แตกต่างกันในกลุ่ม NPE เมื่อเปรียบเทียบกับ IL-17 และ IFN-γ ในเวลาเดียวกัน การแสดงออกของ mRNA ของ IFN-γ ในกลุ่ม NPE นั้นสูงกว่าในกลุ่มอื่นอย่างมีนัยสำคัญ ดังนั้นการผลิต IFN-γ อาจเป็นสื่อกลางของการตอบสนองต่อการอักเสบที่เกิดจากการแทรกสอดของ NP การศึกษาพบว่า IFN-γ ผลิตโดยเซลล์หลายประเภท รวมถึงทีเซลล์ตัวช่วยประเภท 1 เซลล์นักฆ่าตามธรรมชาติ และมาโครฟาจ35,36 และเป็นไซโตไคน์ที่ทำให้เกิดการอักเสบที่สำคัญซึ่งส่งเสริมการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกัน37
การศึกษานี้ชี้ให้เห็นว่าการตอบสนองภูมิต้านทานตนเองอาจเกี่ยวข้องกับการเกิดขึ้นและการพัฒนาของ MC ลูมา และคณะ พบว่าลักษณะสัญญาณของ MC และ NP ที่โดดเด่นมีความคล้ายคลึงกันใน MRI และทั้งสองแสดงสัญญาณสูงในลำดับ T2W ไซโตไคน์บางชนิดได้รับการยืนยันว่าเกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับการเกิดขึ้นของ MC เช่น IL-139 แม่และคณะ ชี้ให้เห็นว่าการยื่นออกมาของ NP ขึ้นหรือลงอาจมีอิทธิพลอย่างมากต่อการเกิดขึ้นและการพัฒนาของ MC12 Bobechko และ Herzbein และคณะ รายงานว่า NP เป็นเนื้อเยื่อที่ทนต่อภูมิคุ้มกันที่ไม่สามารถไหลเวียนของหลอดเลือดได้ตั้งแต่แรกเกิด ส่วนที่ยื่นออกมาของ NP จะนำสิ่งแปลกปลอมเข้าสู่แหล่งเลือด ดังนั้นจึงเป็นสื่อกลางในปฏิกิริยาแพ้ภูมิตัวเองในท้องถิ่น ปฏิกิริยาภูมิต้านทานตนเองสามารถกระตุ้นให้เกิดปัจจัยภูมิคุ้มกันจำนวนมาก และเมื่อปัจจัยเหล่านี้สัมผัสกับเนื้อเยื่ออย่างต่อเนื่อง ก็อาจทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงในการส่งสัญญาณได้43 ในการศึกษานี้ การแสดงออกมากเกินไปของ IL-4, IL-17 และ IFN-γ เป็นปัจจัยภูมิคุ้มกันโดยทั่วไป ซึ่งพิสูจน์ให้เห็นถึงความสัมพันธ์ใกล้ชิดระหว่าง NP และ MCs44 โมเดลสัตว์นี้เลียนแบบการพัฒนา NP และการเข้าสู่แผ่นปิดได้เป็นอย่างดี กระบวนการนี้เปิดเผยเพิ่มเติมถึงผลกระทบของภูมิต้านทานตนเองต่อ MC
ตามที่คาดไว้ แบบจำลองสัตว์นี้ทำให้เรามีแพลตฟอร์มที่เป็นไปได้ในการศึกษา MC อย่างไรก็ตาม แบบจำลองนี้ยังคงมีข้อจำกัดบางประการ ประการแรก ในระหว่างขั้นตอนการสังเกตสัตว์ กระต่ายระยะกลางบางตัวจำเป็นต้องถูกการุณยฆาตเพื่อการทดสอบทางเนื้อเยื่อวิทยาและอณูชีววิทยา ดังนั้น สัตว์บางตัวจึง "เลิกใช้" เมื่อเวลาผ่านไป ประการที่สอง แม้ว่าจะมีการกำหนดจุดเวลาไว้สามจุดในการศึกษานี้ แต่น่าเสียดายที่เราจำลอง MC เพียงประเภทเดียวเท่านั้น (ประเภท Modic ที่ฉันเปลี่ยน) ดังนั้นจึงไม่เพียงพอที่จะแสดงกระบวนการพัฒนาโรคของมนุษย์ และจำเป็นต้องตั้งค่าจุดเวลาเพิ่มเติม สังเกตการเปลี่ยนแปลงของสัญญาณทั้งหมดได้ดีขึ้น ประการที่สาม การเปลี่ยนแปลงโครงสร้างเนื้อเยื่อสามารถแสดงให้เห็นได้อย่างชัดเจนโดยการย้อมสีเนื้อเยื่อ แต่เทคนิคพิเศษบางอย่างสามารถเปิดเผยการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างจุลภาคในแบบจำลองนี้ได้ดีกว่า ตัวอย่างเช่น กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงโพลาไรซ์ถูกนำมาใช้ในการวิเคราะห์การก่อตัวของไฟโบรกระดูกอ่อนในหมอนรองกระดูกสันหลังของกระต่าย ผลกระทบระยะยาวของ NP ต่อ MC และแผ่นปิดต้องมีการศึกษาเพิ่มเติม
กระต่ายขาวนิวซีแลนด์เพศผู้จำนวน 54 ตัว (น้ำหนักประมาณ 2.5-3 กก. อายุ 3-3.5 เดือน) ได้รับการสุ่มแบ่งออกเป็นกลุ่มผ่าตัดหลอก กลุ่มปลูกถ่ายกล้ามเนื้อ (กลุ่ม ME) และกลุ่มปลูกถ่ายรากประสาท (กลุ่ม NPE) ขั้นตอนการทดลองทั้งหมดได้รับการอนุมัติโดยคณะกรรมการจริยธรรมของโรงพยาบาลเทียนจิน และวิธีการทดลองได้ดำเนินการตามแนวทางที่ได้รับอนุมัติอย่างเคร่งครัด
มีการปรับปรุงเทคนิคการผ่าตัดของ S. Sobajima 46 บางส่วน กระต่ายแต่ละตัวถูกวางในตำแหน่งนอนตะแคง และพื้นผิวด้านหน้าของแผ่นดิสก์กระดูกสันหลังส่วนเอว (IVD) ห้าแผ่นที่ติดกันถูกเปิดเผยโดยใช้วิธีส่องช่องท้องด้านหลังหลัง กระต่ายแต่ละตัวได้รับการดมยาสลบ (ยูรีเทน 20%, 5 มล./กก. ผ่านทางหลอดเลือดดำที่หู) กรีดตามยาวของผิวหนังเริ่มจากขอบล่างของซี่โครงถึงขอบอุ้งเชิงกราน ท้องประมาณ 2 ซม. ถึงกล้ามเนื้อพารากระดูกสันหลัง กระดูกสันหลังส่วนหน้าด้านขวาจาก L1 ถึง L6 ถูกเปิดเผยโดยการผ่าเนื้อเยื่อใต้ผิวหนังที่อยู่ด้านบน เนื้อเยื่อเยื่อบุช่องท้อง และกล้ามเนื้ออย่างแหลมคมและทื่อ (รูปที่ 6A) ระดับของแผ่นดิสก์ถูกกำหนดโดยใช้ปีกกระดูกเชิงกรานเป็นจุดสังเกตทางกายวิภาคสำหรับระดับของแผ่นดิสก์ L5-L6 ใช้เข็มเจาะขนาด 16 เกจเจาะรูใกล้กับแผ่นปลายของกระดูกสันหลัง L5 ให้ลึก 3 มม. (รูปที่ 6B) ใช้หลอดฉีดยาขนาด 5 มล. เพื่อดูดนิวเคลียสพัลโพซัสของออโตโลกัสในหมอนรองกระดูกสันหลัง L1-L2 (รูปที่ 6C) ถอดนิวเคลียสพัลโพซัสหรือกล้ามเนื้อออกตามความต้องการของแต่ละกลุ่ม หลังจากที่เจาะลึกลงไปแล้ว จะมีการเย็บไหมแบบดูดซับได้ไว้บนพังผืดลึก พังผืดผิวเผิน และผิวหนัง ระวังอย่าให้เนื้อเยื่อเชิงกรานเสียหายของร่างกายกระดูกสันหลังในระหว่างการผ่าตัด
(A) แผ่นดิสก์ L5–L6 ถูกเปิดเผยโดยวิธี retroperitoneal (B) ใช้เข็มขนาด 16 เกจเจาะรูใกล้กับแผ่นปิดท้าย L5 (C) MF อัตโนมัติจะถูกเก็บเกี่ยว
การดมยาสลบทำได้โดยใช้ยูรีเทน 20% (5 มล./กก.) ผ่านทางหลอดเลือดดำที่ใบหู และทำการถ่ายภาพรังสีกระดูกสันหลังส่วนเอวซ้ำที่ 12, 16 และ 20 สัปดาห์หลังการผ่าตัด
กระต่ายเสียสละโดยการฉีดคีตามีนเข้ากล้าม (25.0 มก./กก.) และโซเดียม เพนโทบาร์บาร์บิทอลทางหลอดเลือดดำ (1.2 ก./กก.) ที่ 12, 16 และ 20 สัปดาห์หลังการผ่าตัด กระดูกสันหลังทั้งหมดถูกเอาออกเพื่อการวิเคราะห์ทางเนื้อเยื่อวิทยาและทำการวิเคราะห์จริง การถอดรหัสแบบย้อนกลับเชิงปริมาณ (RT-qPCR) และ Western blotting ถูกนำมาใช้เพื่อตรวจจับการเปลี่ยนแปลงของปัจจัยภูมิคุ้มกัน
การตรวจ MRI ดำเนินการในกระต่ายโดยใช้แม่เหล็กทางคลินิก 3.0 T (GE Medical Systems, ฟลอเรนซ์, เซาท์แคโรไลนา) ที่ติดตั้งตัวรับคอยล์แขนขาตั้งฉาก กระต่ายได้รับการดมยาสลบด้วยยูรีเทน 20% (5 มล./กก.) ผ่านทางหลอดเลือดดำที่หู จากนั้นให้นอนหงายภายในแม่เหล็กโดยให้บริเวณเอวอยู่ตรงกลางของขดลวดพื้นผิวทรงกลมขนาดเส้นผ่านศูนย์กลาง 5 นิ้ว (GE Medical Systems) ได้รับอิมเมจ Localizer ที่ถ่วงน้ำหนัก Coronal T2 (TR, 1445 ms; TE, 37 ms) เพื่อกำหนดตำแหน่งของแผ่นดิสก์เกี่ยวกับเอวจาก L3 – L4 ถึง L5 – L6 ได้รับชิ้นส่วนที่ถ่วงน้ำหนักระนาบ T2 ของ Sagittal ด้วยการตั้งค่าต่อไปนี้: ลำดับการหมุนสะท้อนอย่างรวดเร็วด้วยเวลาการทำซ้ำ (TR) 2200 ms และเวลาสะท้อน (TE) 70 ms, เมทริกซ์; ลานสายตา 260 และแปดสิ่งเร้า ความหนาในการตัด 2 มม. ช่องว่าง 0.2 มม.
หลังจากถ่ายภาพสุดท้ายและกระต่ายตัวสุดท้ายถูกฆ่า แผ่นเสแสร้ง ที่ฝังกล้ามเนื้อ และแผ่น NP จะถูกเอาออกเพื่อตรวจสอบเนื้อเยื่อวิทยา เนื้อเยื่อได้รับการแก้ไขในฟอร์มาลินบัฟเฟอร์ที่เป็นกลาง 10% เป็นเวลา 1 สัปดาห์ รูปลอกซิกไลต์ด้วยกรดเอทิลีนไดเอมีนเตตราอะซิติก และแบ่งพาราฟิน บล็อกเนื้อเยื่อถูกฝังในพาราฟินและตัดเป็นส่วนทัล (หนา 5 ไมโครเมตร) โดยใช้ไมโครโตม ส่วนต่างๆ ถูกย้อมด้วยฮีมาทอกซิลินและอีโอซิน (H&E)
หลังจากรวบรวมแผ่นดิสก์ intervertebral จากกระต่ายในแต่ละกลุ่ม RNA ทั้งหมดจะถูกสกัดโดยใช้คอลัมน์ UNIQ-10 (Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd., China) ตามคำแนะนำของผู้ผลิตและระบบการถอดความแบบย้อนกลับ ImProm II (Promega Inc. , เมดิสัน, วิสคอนซิน, สหรัฐอเมริกา) ดำเนินการถอดรหัสแบบย้อนกลับ
RT-qPCR ดำเนินการโดยใช้ Prism 7300 (Applied Biosystems Inc., USA) และ SYBR Green Jump Start Taq ReadyMix (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ปริมาตรปฏิกิริยา PCR คือ 20 ไมโครลิตร และมี cDNA เจือจาง 1.5 ไมโครลิตร และไพรเมอร์แต่ละตัว 0.2 ไมโครโมลาร์ สีรองพื้นได้รับการออกแบบโดย OligoPerfect Designer (Invitrogen, Valencia, CA) และผลิตโดย Nanjing Golden Stewart Biotechnology Co., Ltd. (จีน) (ตารางที่ 1) มีการใช้สภาวะการหมุนเวียนด้วยความร้อนต่อไปนี้: ขั้นตอนการกระตุ้นโพลีเมอเรสเริ่มต้นที่ 94°C เป็นเวลา 2 นาที จากนั้น 40 รอบ ครั้งละ 15 วินาทีที่ 94°C สำหรับการทำให้สภาพธรรมชาติของแม่แบบ การหลอมเป็นเวลา 1 นาทีที่ 60°C การขยายออก และการเรืองแสง ทำการวัดเป็นเวลา 1 นาทีที่ 72°C ตัวอย่างทั้งหมดถูกขยายสามครั้งและค่าเฉลี่ยถูกใช้สำหรับการวิเคราะห์ RT-qPCR วิเคราะห์ข้อมูลการขยายโดยใช้ FlexStation 3 (อุปกรณ์โมเลกุล, ซันนีเวล, แคลิฟอร์เนีย, สหรัฐอเมริกา) การแสดงออกของยีน IL-4, IL-17 และ IFN-γ ถูกทำให้เป็นมาตรฐานกับการควบคุมภายนอก (ACTB) ระดับการแสดงออกสัมพัทธ์ของ mRNA เป้าหมายถูกคำนวณโดยใช้วิธี 2-ΔΔCT
สกัดโปรตีนทั้งหมดจากเนื้อเยื่อโดยใช้เครื่องทำให้เนื้อเยื่อเป็นเนื้อเดียวกันในบัฟเฟอร์ไลซิส RIPA (ซึ่งประกอบด้วยค็อกเทลโปรตีเอสและสารยับยั้งฟอสฟาเตส) จากนั้นปั่นเหวี่ยงที่ 13,000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 20 นาทีที่ 4°C เพื่อกำจัดเศษเนื้อเยื่อออก โหลดโปรตีนห้าสิบไมโครกรัมต่อเลน คั่นด้วย SDS-PAGE 10% จากนั้นถ่ายโอนไปยังเมมเบรน PVDF ทำการบล็อกในนมแห้งไม่มีไขมัน 5% ในน้ำเกลือทริสบัฟเฟอร์ (TBS) ที่มี Tween 20 0.1% เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง เมมเบรนถูกบ่มด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิต่อต้านการตกแต่งกระต่าย (เจือจาง 1:200; Boster, หวู่ฮั่น, จีน) (เจือจาง 1:200; Bioss, ปักกิ่ง, จีน) ข้ามคืนที่ 4 ° C และทำปฏิกิริยาในวันที่สอง; ด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิ (อิมมูโนโกลบูลิน G ต่อต้านกระต่ายแพะที่เจือจาง 1:40,000) รวมกับฮอสแรดิชเปอร์ออกซิเดส (โบสเตอร์, หวู่ฮั่น, จีน) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง ตรวจพบสัญญาณ Western blot โดยการเพิ่มเคมีเรืองแสงบนเมมเบรนเคมีเรืองแสงหลังจากการฉายรังสีเอกซ์ สำหรับการวิเคราะห์เดนซิโตเมตริก บล็อตถูกสแกนและหาปริมาณโดยใช้ซอฟต์แวร์ BandScan และผลลัพธ์ถูกแสดงเป็นอัตราส่วนของปฏิกิริยาภูมิคุ้มกันของยีนเป้าหมายต่อปฏิกิริยาภูมิคุ้มกันของทูบูลิน
การคำนวณทางสถิติดำเนินการโดยใช้ชุดซอฟต์แวร์ SPSS16.0 (SPSS, USA) ข้อมูลที่รวบรวมในระหว่างการศึกษาแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน (ค่าเฉลี่ย ± SD) และวิเคราะห์โดยใช้การวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบวัดซ้ำทางเดียว (ANOVA) เพื่อกำหนดความแตกต่างระหว่างทั้งสองกลุ่ม P <0.05 ถือว่ามีนัยสำคัญทางสถิติ
ดังนั้น การสร้างแบบจำลองสัตว์ของ MC โดยการฝัง NPs แบบอัตโนมัติเข้าไปในร่างกายของกระดูกสันหลัง และทำการสังเกตทางกายวิภาคศาสตร์มหภาค การวิเคราะห์ด้วย MRI การประเมินทางเนื้อเยื่อวิทยา และการวิเคราะห์อณูชีววิทยา อาจกลายเป็นเครื่องมือสำคัญในการประเมินและทำความเข้าใจกลไกของ MC ของมนุษย์ และพัฒนาวิธีการรักษาแบบใหม่ การแทรกแซง
วิธีอ้างอิงบทความนี้: Han, C. และคณะ แบบจำลองสัตว์ของการเปลี่ยนแปลงแบบโมดิกถูกสร้างขึ้นโดยการปลูกถ่ายนิวเคลียสพัลโพซัสแบบออโตโลกัสเข้าไปในกระดูกใต้กระดูกเชิงกรานของกระดูกสันหลังส่วนเอว วิทยาศาสตร์ ตัวแทน 6 35102: 10.1038/srep35102 (2016)
Weishaupt, D. , Zanetti, M. , Hodler, J. , และ Boos, N. การถ่ายภาพด้วยคลื่นสนามแม่เหล็กของกระดูกสันหลังส่วนเอว: ความชุกของหมอนรองและการเก็บรักษาของแผ่นดิสก์, การบีบอัดรากประสาท, ความผิดปกติของแผ่นปลาย, และโรคข้อเข่าเสื่อมร่วมด้านในอาสาสมัครที่ไม่มีอาการ . ประเมิน. รังสีวิทยา 209, 661–666, doi:10.1148/radiology.209.3.9844656 (1998)
Kjaer, P. , Korsholm, L. , Bendix, T. , Sorensen, JS และ Leboeuf-Eed, K. Modic การเปลี่ยนแปลงและความสัมพันธ์กับการค้นพบทางคลินิก European Spine Journal: การตีพิมพ์อย่างเป็นทางการของ European Spine Society, European Society of Spinal Deformity และ European Society for Cervical Spine Research 15, 1312–1319, doi: 10.1007/s00586-006-0185-x (2006)
Kuisma, M. , และคณะ การเปลี่ยนแปลงเล็กน้อยในแผ่นปิดกระดูกสันหลังส่วนเอว: ความชุกและความสัมพันธ์กับอาการปวดหลังส่วนล่างและอาการปวดตะโพกในคนงานชายวัยกลางคน สไปน์ 32, 1116–1122, doi:10.1097/01.brs.0000261561.12944.ff (2007)
de Roos, A. , Kressel, H. , Spritzer, K. , และ Dalinka, M. MRI ของไขกระดูกเปลี่ยนแปลงใกล้แผ่นปลายในโรคความเสื่อมของกระดูกสันหลังส่วนเอว อจ. วารสารรังสีวิทยาอเมริกัน 149, 531–534, doi: 10.2214/ajr.149.3.531 (1987)
Modic, MT, Steinberg, PM, Ross, JS, Masaryk, TJ และ Carter, JR โรคความเสื่อมของแผ่นดิสก์: การประเมินการเปลี่ยนแปลงของไขสันหลังด้วย MRI รังสีวิทยา 166, 193–199, doi:10.1148/radiology.166.1.3336678 (1988)
Modic, MT, Masaryk, TJ, Ross, JS และ Carter, JR Imaging ของโรคแผ่นดิสก์เสื่อม รังสีวิทยา 168, 177–186, ดอย: 10.1148/radiology.168.1.3289089 (1988)
เจนเซ่น TS และคณะ ตัวทำนายการเปลี่ยนแปลงสัญญาณแผ่นปลายกระดูกสันหลังส่วนปลาย (Modic) ในประชากรทั่วไป European Spine Journal: การตีพิมพ์อย่างเป็นทางการของ European Spine Society, European Society of Spinal Deformity และ European Society for Cervical Spine Research, Division 19, 129–135, doi: 10.1007/s00586-009-1184-5 (2010)
Albert, HB และ Mannisch, K. Modic เปลี่ยนแปลงหลังหมอนรองเอว European Spine Journal : การตีพิมพ์อย่างเป็นทางการของ European Spine Society, European Society of Spinal Deformity และ European Society for Cervical Spine Research 16, 977–982, doi: 10.1007/s00586-007-0336-8 (2007)
Kerttula, L. , Luoma, K. , Vehmas, T. , Gronblad, M. , และ Kaapa, E. การเปลี่ยนแปลงประเภท Modic I สามารถทำนายการเสื่อมสภาพของแผ่นดิสก์ที่เปลี่ยนรูปอย่างรวดเร็วอย่างรวดเร็ว: การศึกษาในอนาคต 1 ปี วารสารกระดูกสันหลังแห่งยุโรป 21, 1135–1142, doi: 10.1007/s00586-012-2147-9 (2012)
Hu, ZJ, Zhao, FD, Fang, XQ และ Fan, การเปลี่ยนแปลง SW Modic: สาเหตุที่เป็นไปได้และมีส่วนทำให้เกิดความเสื่อมของหมอนรองเอว สมมติฐานทางการแพทย์ 73, 930–932, ดอย: 10.1016/j.mehy.2009.06.038 (2009)
Krok, HV การแตกของแผ่นดิสก์ภายใน ปัญหาแผ่นดิสก์ย้อยกว่า 50 ปี สไปน์ (ฟิลา ปา 1976) 11, 650–653 (1986)
เวลาโพสต์: Dec-13-2024