ขอบคุณที่เข้าชม Nature.com เบราว์เซอร์ที่คุณใช้อยู่มีการรองรับ CSS อย่างจำกัด เพื่อผลลัพธ์ที่ดีที่สุด เราขอแนะนำให้ใช้เบราว์เซอร์เวอร์ชันใหม่กว่า (หรือปิดโหมดความเข้ากันได้ใน Internet Explorer) ในระหว่างนี้ เพื่อให้มั่นใจว่าเว็บไซต์จะยังคงได้รับการสนับสนุนต่อไป เราจะแสดงเว็บไซต์โดยไม่มีสไตล์และ JavaScript
การสร้างแบบจำลองสัตว์ทดลองของการเปลี่ยนแปลงโมดิก (MC) เป็นพื้นฐานสำคัญสำหรับการศึกษา MC กระต่ายพันธุ์นิวซีแลนด์ไวท์จำนวน 54 ตัวถูกแบ่งออกเป็นกลุ่มควบคุม (กลุ่มผ่าตัดหลอก) กลุ่มปลูกถ่ายกล้ามเนื้อ (กลุ่ม ME) และกลุ่มปลูกถ่ายนิวเคลียสพัลโพซัส (กลุ่ม NPE) ในกลุ่ม NPE ทำการผ่าตัดเปิดหมอนรองกระดูกสันหลังโดยใช้เทคนิคการผ่าตัดบริเวณเอวทางด้านหน้าและด้านข้าง และใช้เข็มเจาะกระดูกสันหลังส่วน L5 ใกล้กับแผ่นปลายกระดูก จากนั้นดูดเอาเนื้อเยื่อนิวเคลียสพัลโพซัส (NP) จากหมอนรองกระดูกสันหลังส่วน L1/2 โดยใช้เข็มฉีดยาและฉีดเข้าไปในรูที่เจาะไว้ในกระดูกใต้กระดูกอ่อน ขั้นตอนการผ่าตัดและวิธีการเจาะในกลุ่มปลูกถ่ายกล้ามเนื้อและกลุ่มควบคุมนั้นเหมือนกับกลุ่มปลูกถ่าย NP ในกลุ่ม ME ใส่ชิ้นส่วนกล้ามเนื้อเข้าไปในรู ในขณะที่กลุ่มควบคุมไม่ได้ใส่อะไรเข้าไปในรู หลังจากผ่าตัดแล้ว ทำการสแกน MRI และทดสอบทางชีวโมเลกุล สัญญาณในกลุ่ม NPE เปลี่ยนแปลงไป แต่ไม่มีการเปลี่ยนแปลงของสัญญาณที่ชัดเจนในกลุ่มควบคุมและกลุ่ม ME การสังเกตทางเนื้อเยื่อวิทยาแสดงให้เห็นว่ามีการเจริญเติบโตของเนื้อเยื่อที่ผิดปกติบริเวณที่ฝัง และมีการแสดงออกของ IL-4, IL-17 และ IFN-γ เพิ่มขึ้นในกลุ่ม NPE การฝัง NP ลงในกระดูกใต้กระดูกอ่อนสามารถสร้างแบบจำลองสัตว์ของ MC ได้
การเปลี่ยนแปลงของโมดิก (Modic changes หรือ MC) คือรอยโรคที่แผ่นปลายกระดูกสันหลังและไขกระดูกที่อยู่ติดกัน ซึ่งสามารถมองเห็นได้จากการตรวจด้วยเครื่องสร้างภาพด้วยคลื่นแม่เหล็กไฟฟ้า (MRI) รอยโรคนี้พบได้ค่อนข้างบ่อยในผู้ที่มีอาการที่เกี่ยวข้อง1 มีการศึกษาหลายชิ้นที่เน้นย้ำถึงความสำคัญของ MC เนื่องจากมีความสัมพันธ์กับอาการปวดหลังส่วนล่าง (LBP)2,3 de Roos et al.4 และ Modic et al.5 เป็นกลุ่มแรกที่อธิบายถึงความผิดปกติของสัญญาณใต้กระดูกอ่อนในไขกระดูกสันหลัง 3 ประเภทที่แตกต่างกัน การเปลี่ยนแปลงของโมดิกประเภทที่ 1 มีความเข้มต่ำในภาพ T1-weighted (T1W) และมีความเข้มสูงในภาพ T2-weighted (T2W) รอยโรคนี้แสดงให้เห็นรอยแตกที่แผ่นปลายกระดูกและเนื้อเยื่อเม็ดเลือดที่อยู่ติดกันในไขกระดูก การเปลี่ยนแปลงของโมดิกประเภทที่ 2 แสดงสัญญาณสูงทั้งในภาพ T1W และ T2W ในรอยโรคประเภทนี้ สามารถพบการทำลายแผ่นปลายกระดูก รวมถึงการแทนที่ด้วยไขมันในไขกระดูกที่อยู่ติดกันได้ การเปลี่ยนแปลงประเภท Modic III แสดงสัญญาณต่ำในลำดับภาพ T1W และ T2W มีการสังเกตพบรอยโรคแข็งตัวที่สอดคล้องกับแผ่นปลายกระดูกสันหลัง6 MC ถือเป็นโรคทางพยาธิวิทยาของกระดูกสันหลังและมีความเกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับโรคเสื่อมของกระดูกสันหลังหลายชนิด7,8,9
จากข้อมูลที่มีอยู่ การศึกษาหลายชิ้นได้ให้ข้อมูลเชิงลึกโดยละเอียดเกี่ยวกับสาเหตุและกลไกทางพยาธิวิทยาของ MC อัลเบิร์ตและคณะเสนอว่า MC อาจเกิดจากหมอนรองกระดูกเคลื่อน8 หูและคณะระบุว่า MC เกิดจากการเสื่อมของหมอนรองกระดูกอย่างรุนแรง10 คร็อกเสนอแนวคิดเรื่อง “การฉีกขาดภายในของหมอนรองกระดูก” ซึ่งระบุว่าการบาดเจ็บของหมอนรองกระดูกซ้ำๆ อาจนำไปสู่การฉีกขาดเล็กๆ ในแผ่นปลาย หลังจากเกิดรอยแยก การทำลายแผ่นปลายโดยนิวเคลียสพัลโพซัส (NP) อาจกระตุ้นการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกัน ซึ่งนำไปสู่การพัฒนาของ MC ต่อไป11 มาและคณะมีความเห็นคล้ายกันและรายงานว่าภูมิคุ้มกันที่เกิดจาก NP มีบทบาทสำคัญในพยาธิกำเนิดของ MC12
เซลล์ระบบภูมิคุ้มกัน โดยเฉพาะลิมโฟไซต์ CD4+ T helper มีบทบาทสำคัญในการเกิดโรคภูมิต้านตนเอง13 เซลล์ Th17 ที่เพิ่งค้นพบนั้นผลิตไซโตไคน์ที่ก่อให้เกิดการอักเสบอย่าง IL-17 ส่งเสริมการแสดงออกของเคโมไคน์ และกระตุ้นเซลล์ T ในอวัยวะที่เสียหายให้ผลิต IFN-γ14 เซลล์ Th2 ยังมีบทบาทเฉพาะในการเกิดโรคของการตอบสนองทางภูมิคุ้มกัน การแสดงออกของ IL-4 ซึ่งเป็นตัวแทนของเซลล์ Th2 สามารถนำไปสู่ผลกระทบทางภูมิคุ้มกันที่รุนแรงได้15
แม้ว่าจะมีการศึกษาทางคลินิกมากมายเกี่ยวกับ MC16,17,18,19,20,21,22,23,24 แต่ก็ยังขาดแบบจำลองสัตว์ทดลองที่เหมาะสมซึ่งสามารถเลียนแบบกระบวนการ MC ที่เกิดขึ้นบ่อยในมนุษย์และสามารถนำมาใช้ในการตรวจสอบสาเหตุหรือการรักษาใหม่ ๆ เช่น การบำบัดแบบมุ่งเป้า จนถึงปัจจุบัน มีเพียงไม่กี่แบบจำลองสัตว์ของ MC ที่ได้รับการรายงานเพื่อศึกษาถึงกลไกทางพยาธิวิทยาที่อยู่เบื้องหลัง
จากทฤษฎีภูมิคุ้มกันตนเองที่เสนอโดย Albert และ Ma งานวิจัยนี้ได้สร้างแบบจำลอง MC ในกระต่ายที่ง่ายและทำซ้ำได้ โดยการปลูกถ่าย NP ใกล้กับแผ่นกระดูกสันหลังที่เจาะไว้ วัตถุประสงค์อื่นๆ คือการสังเกตลักษณะทางเนื้อเยื่อวิทยาของแบบจำลองสัตว์ และประเมินกลไกเฉพาะของ NP ในการพัฒนา MC เพื่อบรรลุเป้าหมายนี้ เราใช้เทคนิคต่างๆ เช่น ชีววิทยาระดับโมเลกุล MRI และการศึกษาทางเนื้อเยื่อวิทยา เพื่อศึกษาความก้าวหน้าของ MC
กระต่าย 2 ตัวเสียชีวิตจากการตกเลือดระหว่างการผ่าตัด และกระต่าย 4 ตัวเสียชีวิตระหว่างการวางยาสลบเพื่อทำ MRI กระต่ายที่เหลืออีก 48 ตัวรอดชีวิตและไม่แสดงอาการผิดปกติทางพฤติกรรมหรือระบบประสาทหลังการผ่าตัด
ผลการตรวจ MRI แสดงให้เห็นว่าความเข้มของสัญญาณของเนื้อเยื่อที่ฝังอยู่ในรูต่างๆ นั้นแตกต่างกัน ความเข้มของสัญญาณของกระดูกสันหลังส่วน L5 ในกลุ่ม NPE ค่อยๆ เปลี่ยนไปในสัปดาห์ที่ 12, 16 และ 20 หลังการฝัง (ลำดับภาพ T1W แสดงสัญญาณต่ำ และลำดับภาพ T2W แสดงสัญญาณผสมบวกสัญญาณต่ำ) (รูปที่ 1C) ในขณะที่ลักษณะภาพ MRI ของชิ้นส่วนที่ฝังในอีกสองกลุ่มยังคงค่อนข้างคงที่ในช่วงเวลาเดียวกัน (รูปที่ 1A, B)
(A) ภาพ MRI กระดูกสันหลังส่วนเอวของกระต่ายที่แสดงลำดับเหตุการณ์ ณ 3 ช่วงเวลา ไม่พบความผิดปกติของสัญญาณในภาพของกลุ่มควบคุม (B) ลักษณะสัญญาณของกระดูกสันหลังในกลุ่ม ME คล้ายกับกลุ่มควบคุม และไม่พบการเปลี่ยนแปลงของสัญญาณอย่างมีนัยสำคัญที่บริเวณฝังวัสดุเมื่อเวลาผ่านไป (C) ในกลุ่ม NPE สัญญาณต่ำปรากฏให้เห็นชัดเจนในลำดับภาพ T1W และสัญญาณผสมและสัญญาณต่ำปรากฏให้เห็นชัดเจนในลำดับภาพ T2W ตั้งแต่ช่วง 12 สัปดาห์ถึง 20 สัปดาห์ สัญญาณสูงที่เกิดขึ้นประปรายรอบๆ สัญญาณต่ำในลำดับภาพ T2W ลดลง
สามารถมองเห็นการเจริญเติบโตของกระดูกอย่างชัดเจนบริเวณที่ฝังกระดูกสันหลังในกลุ่ม NPE และการเจริญเติบโตของกระดูกเกิดขึ้นเร็วขึ้นในช่วง 12 ถึง 20 สัปดาห์ (รูปที่ 2C) เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่ม NPE ที่ไม่พบการเปลี่ยนแปลงที่สำคัญในกระดูกสันหลังที่จำลองขึ้น กลุ่ม Sham และกลุ่ม ME (รูปที่ 2C) 2A,B)
(A) พื้นผิวของกระดูกสันหลังบริเวณที่ฝังวัสดุมีความเรียบมาก รูสมานตัวได้ดี และไม่มีการเจริญเติบโตของกระดูกมากเกินไปในกระดูกสันหลัง (B) รูปร่างของบริเวณที่ฝังวัสดุในกลุ่ม ME คล้ายกับกลุ่มควบคุม และไม่มีการเปลี่ยนแปลงที่เห็นได้ชัดในลักษณะของบริเวณที่ฝังวัสดุเมื่อเวลาผ่านไป (C) เกิดการเจริญเติบโตของกระดูกมากเกินไปที่บริเวณที่ฝังวัสดุในกลุ่ม NPE การเจริญเติบโตของกระดูกเพิ่มขึ้นอย่างรวดเร็วและขยายผ่านหมอนรองกระดูกไปยังกระดูกสันหลังด้านตรงข้าม
การวิเคราะห์ทางเนื้อเยื่อวิทยาให้ข้อมูลที่ละเอียดมากขึ้นเกี่ยวกับการสร้างกระดูก รูปที่ 3 แสดงภาพถ่ายของส่วนตัดหลังการผ่าตัดที่ย้อมด้วย H&E ในกลุ่มควบคุม (กลุ่มที่ได้รับการผ่าตัดหลอก) เซลล์กระดูกอ่อนเรียงตัวกันอย่างดีและไม่พบการเพิ่มจำนวนของเซลล์ (รูปที่ 3A) สถานการณ์ในกลุ่ม ME คล้ายกับในกลุ่มควบคุม (รูปที่ 3B) อย่างไรก็ตาม ในกลุ่ม NPE พบเซลล์กระดูกอ่อนจำนวนมากและการเพิ่มจำนวนของเซลล์คล้าย NP ที่บริเวณปลูกถ่าย (รูปที่ 3C)
(A) สามารถมองเห็นกระดูกอ่อนบริเวณใกล้แผ่นปลายกระดูก เซลล์กระดูกอ่อนเรียงตัวอย่างเป็นระเบียบ มีขนาดและรูปร่างสม่ำเสมอ และไม่มีการเพิ่มจำนวน (กำลังขยาย 40 เท่า) (B) สภาพบริเวณที่ปลูกถ่ายในกลุ่ม ME คล้ายกับกลุ่มควบคุม สามารถมองเห็นกระดูกอ่อนและเซลล์กระดูกอ่อนได้ แต่ไม่มีการเพิ่มจำนวนอย่างชัดเจนที่บริเวณที่ปลูกถ่าย (กำลังขยาย 40 เท่า) (B) จะเห็นได้ว่าเซลล์กระดูกอ่อนและเซลล์คล้าย NP เพิ่มจำนวนอย่างมีนัยสำคัญ และรูปร่างและขนาดของเซลล์กระดูกอ่อนไม่สม่ำเสมอ (กำลังขยาย 40 เท่า)
ตรวจพบการแสดงออกของ mRNA ของอินเตอร์ลิวคิน 4 (IL-4), อินเตอร์ลิวคิน 17 (IL-17) และอินเตอร์เฟรอน γ (IFN-γ) ในทั้งกลุ่ม NPE และ ME เมื่อเปรียบเทียบระดับการแสดงออกของยีนเป้าหมาย พบว่าการแสดงออกของยีน IL-4, IL-17 และ IFN-γ เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในกลุ่ม NPE เมื่อเทียบกับกลุ่ม ME และกลุ่มควบคุม (รูปที่ 4) (P < 0.05) เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม ระดับการแสดงออกของ IL-4, IL-17 และ IFN-γ ในกลุ่ม ME เพิ่มขึ้นเพียงเล็กน้อยและไม่มีการเปลี่ยนแปลงทางสถิติอย่างมีนัยสำคัญ (P > 0.05)
การแสดงออกของ mRNA ของ IL-4, IL-17 และ IFN-γ ในกลุ่ม NPE มีแนวโน้มสูงกว่าอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับกลุ่มผ่าตัดหลอกและกลุ่ม ME (P < 0.05)
ในทางตรงกันข้าม ระดับการแสดงออกในกลุ่ม ME ไม่แสดงความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญ (P>0.05)
ทำการวิเคราะห์ด้วยวิธี Western blot โดยใช้แอนติบอดีที่หาซื้อได้ทั่วไปต่อต้าน IL-4 และ IL-17 เพื่อยืนยันรูปแบบการแสดงออกของ mRNA ที่เปลี่ยนแปลงไป ดังแสดงในรูปที่ 5A,B เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่ม ME และกลุ่มควบคุม ระดับโปรตีนของ IL-4 และ IL-17 ในกลุ่ม NPE เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ (P < 0.05) เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม ระดับโปรตีนของ IL-4 และ IL-17 ในกลุ่ม ME ก็ไม่มีการเปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติเช่นกัน (P > 0.05)
(A) ระดับโปรตีนของ IL-4 และ IL-17 ในกลุ่ม NPE สูงกว่ากลุ่ม ME และกลุ่มยาหลอกอย่างมีนัยสำคัญ (P < 0.05) (B) ฮิสโตแกรมของเวสเทิร์นบล็อต
เนื่องจากจำนวนตัวอย่างมนุษย์ที่ได้จากการผ่าตัดมีจำกัด การศึกษาอย่างละเอียดเกี่ยวกับกลไกการเกิดโรค MC จึงค่อนข้างยาก เราจึงพยายามสร้างแบบจำลองสัตว์ทดลองของ MC เพื่อศึกษาถึงกลไกการเกิดโรคที่อาจเกิดขึ้น ในขณะเดียวกัน การประเมินทางรังสีวิทยา การประเมินทางเนื้อเยื่อวิทยา และการประเมินทางชีวโมเลกุลถูกนำมาใช้เพื่อติดตามการดำเนินของโรค MC ที่เกิดจากการปลูกถ่ายเนื้อเยื่อ NP จากร่างกายตนเอง ผลลัพธ์ที่ได้คือ แบบจำลองการปลูกถ่าย NP ส่งผลให้ความเข้มของสัญญาณเปลี่ยนแปลงอย่างค่อยเป็นค่อยไปตั้งแต่สัปดาห์ที่ 12 ถึงสัปดาห์ที่ 20 (สัญญาณต่ำปนกันในลำดับภาพ T1W และสัญญาณต่ำในลำดับภาพ T2W) ซึ่งบ่งชี้ถึงการเปลี่ยนแปลงของเนื้อเยื่อ และการประเมินทางเนื้อเยื่อวิทยาและชีวโมเลกุลได้ยืนยันผลการศึกษาทางรังสีวิทยา
ผลการทดลองนี้แสดงให้เห็นว่ามีการเปลี่ยนแปลงทางภาพและทางเนื้อเยื่อเกิดขึ้นที่บริเวณที่มีการรุกรานของกระดูกสันหลังในกลุ่ม NPE ในขณะเดียวกันก็พบการแสดงออกของยีน IL-4, IL-17 และ IFN-γ รวมถึง IL-4, IL-17 และ IFN-γ ซึ่งบ่งชี้ว่าการรุกรานของเนื้อเยื่อแกนกลางกระดูกสันหลังในกระดูกสันหลังอาจทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงของสัญญาณและรูปร่างต่างๆ จะเห็นได้ว่าลักษณะสัญญาณของกระดูกสันหลังของสัตว์ทดลอง (สัญญาณต่ำในลำดับ T1W สัญญาณผสมและสัญญาณต่ำในลำดับ T2W) มีความคล้ายคลึงกับเซลล์กระดูกสันหลังของมนุษย์มาก และลักษณะของ MRI ยังยืนยันการสังเกตทางเนื้อเยื่อวิทยาและกายวิภาคศาสตร์โดยรวม นั่นคือ การเปลี่ยนแปลงในเซลล์กระดูกสันหลังนั้นเกิดขึ้นอย่างต่อเนื่อง แม้ว่าการอักเสบที่เกิดจากบาดแผลเฉียบพลันอาจปรากฏขึ้นไม่นานหลังจากการเจาะ แต่ผลการตรวจ MRI แสดงให้เห็นว่าการเปลี่ยนแปลงของสัญญาณที่เพิ่มขึ้นเรื่อยๆ ปรากฏขึ้น 12 สัปดาห์หลังจากการเจาะ และคงอยู่จนถึง 20 สัปดาห์โดยไม่มีสัญญาณของการฟื้นตัวหรือการกลับคืนสู่สภาพเดิมของการเปลี่ยนแปลงใน MRI ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่านิวเคลียสพัลโปซัสของกระดูกสันหลังแบบอัตโนมัติเป็นวิธีการที่เชื่อถือได้สำหรับการสร้าง MV ที่ก้าวหน้าในกระต่าย
แบบจำลองการเจาะนี้ต้องอาศัยทักษะ เวลา และความพยายามในการผ่าตัดที่เหมาะสม ในการทดลองเบื้องต้น การผ่าตัดหรือการกระตุ้นโครงสร้างเอ็นข้างกระดูกสันหลังมากเกินไปอาจส่งผลให้เกิดกระดูกงอกที่กระดูกสันหลังได้ ควรระมัดระวังไม่ให้เกิดความเสียหายหรือการระคายเคืองต่อหมอนรองกระดูกที่อยู่ติดกัน เนื่องจากต้องควบคุมความลึกของการเจาะเพื่อให้ได้ผลลัพธ์ที่สม่ำเสมอและทำซ้ำได้ เราจึงทำปลั๊กขึ้นเองโดยการตัดปลอกเข็มยาว 3 มม. ออก การใช้ปลั๊กนี้ช่วยให้มั่นใจได้ว่าความลึกของการเจาะในกระดูกสันหลังมีความสม่ำเสมอ ในการทดลองเบื้องต้น ศัลยแพทย์กระดูกและข้อ 3 ท่านที่เกี่ยวข้องกับการผ่าตัดพบว่าเข็มขนาด 16 เกจใช้งานง่ายกว่าเข็มขนาด 18 เกจหรือวิธีการอื่นๆ เพื่อหลีกเลี่ยงการตกเลือดมากเกินไปในระหว่างการเจาะ การจับเข็มให้นิ่งสักครู่จะทำให้ได้รูที่เหมาะสมมากขึ้น ซึ่งบ่งชี้ว่าสามารถควบคุม MC ได้ในระดับหนึ่งด้วยวิธีนี้
แม้ว่าจะมีงานวิจัยจำนวนมากที่มุ่งเป้าไปที่ MC แต่ก็ยังไม่ค่อยมีใครรู้เกี่ยวกับสาเหตุและกลไกการเกิดโรคของ MC25,26,27 จากการศึกษาครั้งก่อนของเรา เราพบว่าภาวะภูมิคุ้มกันบกพร่องมีบทบาทสำคัญในการเกิดและการพัฒนาของ MC12 การศึกษานี้ได้ตรวจสอบการแสดงออกเชิงปริมาณของ IL-4, IL-17 และ IFN-γ ซึ่งเป็นเส้นทางการแยกแยะหลักของเซลล์ CD4+ หลังจากการกระตุ้นด้วยแอนติเจน ในการศึกษาของเรา เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม กลุ่ม NPE มีการแสดงออกของ IL-4, IL-17 และ IFN-γ สูงกว่า และระดับโปรตีนของ IL-4 และ IL-17 ก็สูงกว่าเช่นกัน
ในทางคลินิก การแสดงออกของ mRNA ของ IL-17 เพิ่มขึ้นในเซลล์ NP จากผู้ป่วยที่มีภาวะหมอนรองกระดูกเคลื่อน28 นอกจากนี้ยังพบระดับการแสดงออกของ IL-4 และ IFN-γ ที่เพิ่มขึ้นในแบบจำลองภาวะหมอนรองกระดูกเคลื่อนแบบเฉียบพลันที่ไม่เกิดจากการกดทับ เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุมที่มีสุขภาพดี29 IL-17 มีบทบาทสำคัญในการอักเสบ การบาดเจ็บของเนื้อเยื่อในโรคภูมิต้านตนเอง30 และช่วยเสริมการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันต่อ IFN-γ31 มีรายงานการบาดเจ็บของเนื้อเยื่อที่เพิ่มขึ้นจาก IL-17 ในหนู MRL/lpr32 และหนูที่ไวต่อโรคภูมิต้านตนเอง33 IL-4 สามารถยับยั้งการแสดงออกของไซโตไคน์ที่ก่อให้เกิดการอักเสบ (เช่น IL-1β และ TNFα) และการกระตุ้นของแมโครฟาจ34 มีรายงานว่าการแสดงออกของ mRNA ของ IL-4 แตกต่างกันในกลุ่ม NPE เมื่อเทียบกับ IL-17 และ IFN-γ ในช่วงเวลาเดียวกัน การแสดงออกของ mRNA ของ IFN-γ ในกลุ่ม NPE สูงกว่ากลุ่มอื่นๆ อย่างมีนัยสำคัญ ดังนั้น การผลิต IFN-γ อาจเป็นตัวกลางของการตอบสนองการอักเสบที่เกิดจากการแทรกตัวของ NP การศึกษาต่างๆ แสดงให้เห็นว่า IFN-γ ถูกผลิตโดยเซลล์หลายประเภท รวมถึงเซลล์ T helper ประเภท 1 ที่ถูกกระตุ้น เซลล์นักฆ่าตามธรรมชาติ และแมโครฟาจ35,36 และเป็นไซโตไคน์ที่กระตุ้นการอักเสบที่สำคัญซึ่งส่งเสริมการตอบสนองทางภูมิคุ้มกัน37
การศึกษานี้ชี้ให้เห็นว่าการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกันอัตโนมัติอาจมีส่วนเกี่ยวข้องกับการเกิดและการพัฒนาของ MC Luoma และคณะพบว่าลักษณะสัญญาณของ MC และ NP ที่เด่นชัดนั้นคล้ายคลึงกันใน MRI และทั้งสองแสดงสัญญาณสูงในลำดับ T2W38 มีการยืนยันแล้วว่าไซโตไคน์บางชนิดมีความเกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับการเกิด MC เช่น IL-139 Ma และคณะแนะนำว่าการยื่นขึ้นหรือลงของ NP อาจมีอิทธิพลอย่างมากต่อการเกิดและการพัฒนาของ MC12 Bobechko40 และ Herzbein และคณะ41 รายงานว่า NP เป็นเนื้อเยื่อที่ทนต่อภูมิคุ้มกันซึ่งไม่สามารถเข้าสู่ระบบไหลเวียนโลหิตได้ตั้งแต่แรกเกิด การยื่นของ NP นำสิ่งแปลกปลอมเข้าสู่ระบบไหลเวียนโลหิต จึงทำให้เกิดปฏิกิริยาภูมิคุ้มกันอัตโนมัติเฉพาะที่42 ปฏิกิริยาภูมิคุ้มกันอัตโนมัติสามารถกระตุ้นปัจจัยภูมิคุ้มกันจำนวนมาก และเมื่อปัจจัยเหล่านี้สัมผัสกับเนื้อเยื่ออย่างต่อเนื่อง ก็สามารถทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงในการส่งสัญญาณได้43 ในการศึกษานี้ การแสดงออกมากเกินไปของ IL-4, IL-17 และ IFN-γ เป็นปัจจัยภูมิคุ้มกันทั่วไป ซึ่งพิสูจน์เพิ่มเติมถึงความสัมพันธ์ที่ใกล้ชิดระหว่าง NP และ MCs44 แบบจำลองสัตว์นี้เลียนแบบการทะลุทะลวงและการเข้าสู่แผ่นปลายประสาทของ NP ได้เป็นอย่างดี กระบวนการนี้ยังเผยให้เห็นถึงผลกระทบของภาวะภูมิคุ้มกันบกพร่องต่อ MC อีกด้วย
ดังที่คาดไว้ แบบจำลองสัตว์นี้เป็นแพลตฟอร์มที่เป็นไปได้สำหรับการศึกษา MC อย่างไรก็ตาม แบบจำลองนี้ยังมีข้อจำกัดบางประการ ประการแรก ในระหว่างขั้นตอนการสังเกตสัตว์ กระต่ายในระยะกลางบางตัวจำเป็นต้องถูกทำการุณยฆาตเพื่อทำการทดสอบทางจุลพยาธิวิทยาและชีววิทยาโมเลกุล ดังนั้นสัตว์บางตัวจึง “หมดประโยชน์” ไปตามกาลเวลา ประการที่สอง แม้ว่าจะมีการกำหนดจุดเวลาไว้สามจุดในการศึกษานี้ แต่เราได้จำลอง MC เพียงประเภทเดียว (การเปลี่ยนแปลงแบบ Modic ประเภท I) เท่านั้น ซึ่งไม่เพียงพอที่จะแสดงกระบวนการพัฒนาของโรคในมนุษย์ และจำเป็นต้องกำหนดจุดเวลาเพิ่มเติมเพื่อสังเกตการเปลี่ยนแปลงของสัญญาณทั้งหมดได้ดียิ่งขึ้น ประการที่สาม การเปลี่ยนแปลงในโครงสร้างของเนื้อเยื่อสามารถแสดงให้เห็นได้อย่างชัดเจนโดยการย้อมสีทางจุลพยาธิวิทยา แต่เทคนิคเฉพาะทางบางอย่างสามารถเปิดเผยการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างระดับจุลภาคในแบบจำลองนี้ได้ดีกว่า ตัวอย่างเช่น กล้องจุลทรรศน์แสงโพลาไรซ์ถูกใช้เพื่อวิเคราะห์การก่อตัวของกระดูกอ่อนเส้นใยในหมอนรองกระดูกสันหลังของกระต่าย45 ผลกระทบระยะยาวของ NP ต่อ MC และแผ่นปลายกระดูกสันหลังจำเป็นต้องมีการศึกษาเพิ่มเติม
กระต่ายขาวพันธุ์นิวซีแลนด์เพศผู้จำนวน 54 ตัว (น้ำหนักประมาณ 2.5-3 กิโลกรัม อายุ 3-3.5 เดือน) ถูกแบ่งออกเป็นกลุ่มควบคุม (กลุ่มผ่าตัดหลอก) กลุ่มปลูกถ่ายกล้ามเนื้อ (กลุ่ม ME) และกลุ่มปลูกถ่ายรากประสาท (กลุ่ม NPE) โดยสุ่ม การทดลองทั้งหมดได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการจริยธรรมของโรงพยาบาลเทียนจิน และวิธีการทดลองดำเนินการอย่างเคร่งครัดตามแนวทางที่ได้รับอนุมัติ
มีการปรับปรุงเทคนิคการผ่าตัดของ S. Sobajima 46 บางประการ กระต่ายแต่ละตัวถูกวางในท่านอนตะแคง และพื้นผิวด้านหน้าของหมอนรองกระดูกสันหลังส่วนเอว (IVD) จำนวน 5 ข้อที่อยู่ติดกันถูกเปิดออกโดยใช้แนวทางด้านหลังช่องท้อง กระต่ายแต่ละตัวได้รับยาสลบ (ยูรีเทน 20% 5 มล./กก. ทางเส้นเลือดที่หู) ทำการกรีดผิวหนังตามแนวยาวจากขอบล่างของซี่โครงไปยังขอบกระดูกเชิงกราน ห่างจากกล้ามเนื้อข้างกระดูกสันหลังไปทางด้านหน้า 2 ซม. กระดูกสันหลังส่วนหน้าด้านขวาจาก L1 ถึง L6 ถูกเปิดออกโดยการแยกเนื้อเยื่อใต้ผิวหนัง เนื้อเยื่อหลังช่องท้อง และกล้ามเนื้อที่อยู่เหนือกระดูกสันหลังออกทั้งแบบคมและแบบทื่อ (รูปที่ 6A) ระดับของหมอนรองกระดูกถูกกำหนดโดยใช้ขอบกระดูกเชิงกรานเป็นจุดอ้างอิงทางกายวิภาคสำหรับระดับหมอนรองกระดูก L5-L6 ใช้เข็มเจาะขนาด 16 เกจ เจาะรูใกล้แผ่นปลายกระดูกสันหลังส่วน L5 ให้ลึก 3 มม. (รูปที่ 6B) ใช้กระบอกฉีดยาขนาด 5 มล. ดูดเอาเนื้อเยื่อนิวเคลียสพัลโพซัสจากหมอนรองกระดูกสันหลังส่วน L1-L2 ออกมา (รูปที่ 6C) นำนิวเคลียสพัลโพซัสหรือกล้ามเนื้อออกตามความต้องการของแต่ละกลุ่ม หลังจากเจาะรูให้ลึกขึ้นแล้ว ให้เย็บแผลด้วยไหมละลายที่ชั้นพังผืดชั้นลึก ชั้นพังผืดชั้นตื้น และผิวหนัง โดยระมัดระวังไม่ให้เนื้อเยื่อรอบกระดูกสันหลังเสียหายระหว่างการผ่าตัด
(A) เปิดเผยหมอนรองกระดูกสันหลังระดับ L5–L6 ผ่านทางเข้าด้านหลังช่องท้อง (B) ใช้เข็มเบอร์ 16 เจาะรูใกล้แผ่นปลายกระดูกสันหลังระดับ L5 (C) เก็บเซลล์กล้ามเนื้อเรียบจากผู้ป่วยเอง
ทำการวางยาสลบทั่วไปโดยใช้ยูเรเทน 20% (5 มล./กก.) ฉีดเข้าทางเส้นเลือดที่หู และทำการถ่ายภาพรังสีของกระดูกสันหลังส่วนเอวซ้ำอีกครั้งในสัปดาห์ที่ 12, 16 และ 20 หลังการผ่าตัด
กระต่ายถูกทำให้ตายโดยการฉีดคีตามีนเข้ากล้ามเนื้อ (25.0 มก./กก.) และโซเดียมเพนโทบาร์บิทัลเข้าเส้นเลือด (1.2 กรัม/กก.) ในสัปดาห์ที่ 12, 16 และ 20 หลังการผ่าตัด กระดูกสันหลังทั้งหมดถูกนำออกเพื่อวิเคราะห์ทางเนื้อเยื่อวิทยา และทำการวิเคราะห์เชิงปริมาณโดยใช้การถอดรหัสย้อนกลับเชิงปริมาณ (RT-qPCR) และเวสเทิร์นบลอตติงเพื่อตรวจหาการเปลี่ยนแปลงของปัจจัยภูมิคุ้มกัน
ทำการตรวจ MRI ในกระต่ายโดยใช้เครื่องแม่เหล็กทางการแพทย์ 3.0 T (GE Medical Systems, Florence, SC) ที่ติดตั้งตัวรับสัญญาณขดลวดแบบตั้งฉากกับแขนขา กระต่ายถูกวางยาสลบด้วยยูเรเทน 20% (5 มล./กก.) ทางเส้นเลือดที่หู จากนั้นวางในท่าหงายภายในเครื่องแม่เหล็ก โดยให้บริเวณเอวอยู่ตรงกลางของขดลวดพื้นผิวทรงกลมขนาดเส้นผ่านศูนย์กลาง 5 นิ้ว (GE Medical Systems) ภาพตัดขวางแบบ T2-weighted localizer (TR, 1445 มิลลิวินาที; TE, 37 มิลลิวินาที) ถูกบันทึกเพื่อกำหนดตำแหน่งของหมอนรองกระดูกสันหลังส่วนเอวตั้งแต่ L3–L4 ถึง L5–L6 ภาพตัดขวางแบบ T2-weighted ในระนาบ sagittal ถูกบันทึกด้วยการตั้งค่าดังต่อไปนี้: ลำดับ fast spin-echo ที่มีเวลาทำซ้ำ (TR) 2200 มิลลิวินาที และเวลาสะท้อน (TE) 70 มิลลิวินาที, matrix; ขอบเขตการมองเห็น 260 และตัวกระตุ้นแปดตัว; ความหนาของการตัด 2 มม., ช่องว่าง 0.2 มม.
หลังจากถ่ายภาพสุดท้ายและฆ่ากระต่ายตัวสุดท้ายแล้ว ได้ทำการแยกชิ้นส่วนควบคุม ชิ้นส่วนฝังกล้ามเนื้อ และชิ้นส่วนนิวเคลียสพัลโปซัส (NP discs) ออกเพื่อตรวจทางจุลพยาธิวิทยา ชิ้นส่วนเนื้อเยื่อถูกแช่ในฟอร์มาลินบัฟเฟอร์ที่เป็นกลาง 10% เป็นเวลา 1 สัปดาห์ จากนั้นทำการกำจัดแคลเซียมด้วยกรดเอทิลีนไดอะมีนเตตระอะเซติก (EDTA) และตัดเป็นชิ้นบางๆ ด้วยพาราฟิน ชิ้นเนื้อถูกฝังในพาราฟินและตัดเป็นชิ้นตามแนวระนาบ (หนา 5 ไมโครเมตร) โดยใช้ไมโครโทม จากนั้นย้อมชิ้นเนื้อด้วยฮีมาทอกซิลินและอีโอซิน (H&E)
หลังจากเก็บหมอนรองกระดูกสันหลังจากกระต่ายแต่ละกลุ่มแล้ว ได้ทำการสกัด RNA ทั้งหมดโดยใช้คอลัมน์ UNIQ-10 (บริษัท เซี่ยงไฮ้ ซานกอน ไบโอเทคโนโลยี จำกัด ประเทศจีน) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต และระบบการถอดรหัสย้อนกลับ ImProm II (บริษัท โปรเมกา อิงค์ เมืองแมดิสัน รัฐวิสคอนซิน สหรัฐอเมริกา) จากนั้นจึงทำการถอดรหัสย้อนกลับ
ทำการวิเคราะห์ RT-qPCR โดยใช้เครื่อง Prism 7300 (Applied Biosystems Inc., สหรัฐอเมริกา) และ SYBR Green Jump Start Taq ReadyMix (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, สหรัฐอเมริกา) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ปริมาตรของปฏิกิริยา PCR คือ 20 μl ประกอบด้วย cDNA ที่เจือจาง 1.5 μl และไพรเมอร์แต่ละตัว 0.2 μM ไพรเมอร์ได้รับการออกแบบโดย OligoPerfect Designer (Invitrogen, Valencia, CA) และผลิตโดย Nanjing Golden Stewart Biotechnology Co., Ltd. (ประเทศจีน) (ตารางที่ 1) ใช้เงื่อนไขการวนรอบความร้อนดังต่อไปนี้: ขั้นตอนการกระตุ้นพอลิเมอเรสเริ่มต้นที่ 94°C เป็นเวลา 2 นาที จากนั้น 40 รอบ รอบละ 15 วินาที ที่ 94°C สำหรับการทำให้แม่แบบเสียสภาพ การจับคู่เป็นเวลา 1 นาที ที่ 60°C การยืดตัว และการวัดฟลูออเรสเซนซ์ ทำการวัดเป็นเวลา 1 นาที ที่ 72°C ตัวอย่างทั้งหมดถูกขยายสัญญาณสามครั้ง และใช้ค่าเฉลี่ยสำหรับการวิเคราะห์ RT-qPCR ข้อมูลการขยายสัญญาณได้รับการวิเคราะห์โดยใช้ FlexStation 3 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) การแสดงออกของยีน IL-4, IL-17 และ IFN-γ ถูกปรับให้เป็นมาตรฐานโดยเทียบกับตัวควบคุมภายใน (ACTB) ระดับการแสดงออกสัมพัทธ์ของ mRNA เป้าหมายคำนวณโดยใช้วิธี 2-ΔΔCT
สกัดโปรตีนทั้งหมดจากเนื้อเยื่อโดยใช้เครื่องบดเนื้อเยื่อในบัฟเฟอร์ RIPA lysis (ซึ่งประกอบด้วยสารยับยั้งโปรตีเอสและฟอสฟาเทส) จากนั้นปั่นเหวี่ยงที่ 13,000 รอบต่อนาที เป็นเวลา 20 นาที ที่อุณหภูมิ 4°C เพื่อกำจัดเศษเนื้อเยื่อ ใส่โปรตีน 50 ไมโครกรัมลงในแต่ละเลน แยกด้วย SDS-PAGE 10% แล้วถ่ายโอนไปยังเมมเบรน PVDF ทำการบล็อกด้วยนมผงพร่องมันเนย 5% ในบัฟเฟอร์ Tris (TBS) ที่มี Tween 20 0.1% เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง บ่มเมมเบรนด้วยแอนติบอดีหลักกระต้านเดคอริน (เจือจาง 1:200; Boster, หวู่ฮั่น, จีน) (เจือจาง 1:200; Bioss, ปักกิ่ง, จีน) ข้ามคืนที่อุณหภูมิ 4°C และทำปฏิกิริยาในวันที่สอง โดยใช้แอนติบอดีรอง (แพะต่อต้านอิมมูโนโกลบูลิน G ของกระต่าย ที่ความเจือจาง 1:40,000) ร่วมกับฮอร์สแรดิชเปอร์ออกซิเดส (Boster, หวู่ฮั่น, จีน) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง ตรวจจับสัญญาณเวสเทิร์นบลอตโดยการเพิ่มขึ้นของเคมีเรืองแสงบนเมมเบรนเคมีเรืองแสงหลังจากการฉายรังสีเอ็กซ์ สำหรับการวิเคราะห์ความหนาแน่น บลอตจะถูกสแกนและวัดปริมาณโดยใช้ซอฟต์แวร์ BandScan และผลลัพธ์จะแสดงเป็นอัตราส่วนของปฏิกิริยาภูมิคุ้มกันของยีนเป้าหมายต่อปฏิกิริยาภูมิคุ้มกันของทูบูลิน
การคำนวณทางสถิติได้ดำเนินการโดยใช้โปรแกรม SPSS 16.0 (SPSS, สหรัฐอเมริกา) ข้อมูลที่เก็บรวบรวมระหว่างการศึกษาแสดงในรูปค่าเฉลี่ย ± ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน (ค่าเฉลี่ย ± SD) และวิเคราะห์โดยใช้การวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบวัดซ้ำทางเดียว (ANOVA) เพื่อหาความแตกต่างระหว่างสองกลุ่ม ค่า P < 0.05 ถือว่ามีความสำคัญทางสถิติ
ดังนั้น การสร้างแบบจำลองสัตว์ทดลองของภาวะกระดูกสันหลังคด (MC) โดยการฝังเซลล์ต้นกำเนิดจากร่างกายตนเองเข้าไปในกระดูกสันหลัง และทำการสังเกตทางกายวิภาคระดับมหภาค การวิเคราะห์ด้วย MRI การประเมินทางเนื้อเยื่อวิทยา และการวิเคราะห์ทางชีวโมเลกุล อาจกลายเป็นเครื่องมือสำคัญในการประเมินและทำความเข้าใจกลไกของภาวะกระดูกสันหลังคดในมนุษย์ และการพัฒนาวิธีการรักษาใหม่ๆ
วิธีการอ้างอิงบทความนี้: Han, C. และคณะ การสร้างแบบจำลองสัตว์ทดลองของการเปลี่ยนแปลงแบบ Modic โดยการปลูกถ่ายนิวเคลียสพัลโพซัสจากตัวสัตว์เองลงในกระดูกใต้กระดูกอ่อนของกระดูกสันหลังส่วนเอว Sci. Rep. 6, 35102: 10.1038/srep35102 (2016)
Weishaupt, D., Zanetti, M., Hodler, J. และ Boos, N. การถ่ายภาพด้วยคลื่นแม่เหล็กไฟฟ้าของกระดูกสันหลังส่วนเอว: ความชุกของภาวะหมอนรองกระดูกเคลื่อนและค้าง การกดทับรากประสาท ความผิดปกติของแผ่นปลายกระดูก และโรคข้อเสื่อมของข้อต่อกระดูกสันหลังในอาสาสมัครที่ไม่มีอาการ Radiology 209, 661–666, doi:10.1148/radiology.209.3.9844656 (1998).
Kjaer, P., Korsholm, L., Bendix, T., Sorensen, JS และ Leboeuf-Eed, K. การเปลี่ยนแปลงของ Modic และความสัมพันธ์กับผลการตรวจทางคลินิก European Spine Journal: วารสารทางการของ European Spine Society, European Society of Spinal Deformity และ European Society for Cervical Spine Research 15, 1312–1319, doi: 10.1007/s00586-006-0185-x (2006)
Kuisma, M. และคณะ การเปลี่ยนแปลงของ Modic ในแผ่นปลายกระดูกสันหลังส่วนเอว: ความชุกและความสัมพันธ์กับอาการปวดหลังส่วนล่างและอาการปวดร้าวลงขาในคนงานชายวัยกลางคน Spine 32, 1116–1122, doi:10.1097/01.brs.0000261561.12944.ff (2007)
de Roos, A., Kressel, H., Spritzer, K. และ Dalinka, M. การตรวจ MRI ของการเปลี่ยนแปลงของไขกระดูกบริเวณใกล้แผ่นปลายกระดูกสันหลังในโรคความเสื่อมของกระดูกสันหลังส่วนเอว AJR. American Journal of Radiology 149, 531–534, doi: 10.2214/ajr.149.3.531 (1987)
Modic, MT, Steinberg, PM, Ross, JS, Masaryk, TJ และ Carter, JR โรคหมอนรองกระดูกเสื่อม: การประเมินการเปลี่ยนแปลงของไขกระดูกสันหลังด้วย MRI Radiology 166, 193–199, doi:10.1148/radiology.166.1.3336678 (1988)
Modic, MT, Masaryk, TJ, Ross, JS และ Carter, JR การถ่ายภาพโรคหมอนรองกระดูกเสื่อม Radiology 168, 177–186, doi: 10.1148/radiology.168.1.3289089 (1988)
Jensen, TS และคณะ ปัจจัยทำนายการเปลี่ยนแปลงสัญญาณแผ่นปลายกระดูกสันหลังใหม่ (Modic) ในประชากรทั่วไป European Spine Journal: วารสารทางการของ European Spine Society, European Society of Spinal Deformity และ European Society for Cervical Spine Research, Division 19, 129–135, doi: 10.1007/s00586-009-1184-5 (2010)
Albert, HB และ Mannisch, K. การเปลี่ยนแปลงของ Modic หลังหมอนรองกระดูกสันหลังส่วนเอวเคลื่อน European Spine Journal : Official Publication of the European Spine Society, the European Society of Spinal Deformity and the European Society for Cervical Spine Research 16, 977–982, doi: 10.1007/s00586-007-0336-8 (2007)
Kerttula, L., Luoma, K., Vehmas, T., Gronblad, M. และ Kaapa, E. การเปลี่ยนแปลงประเภท Modic ชนิดที่ 1 สามารถทำนายการเสื่อมของหมอนรองกระดูกแบบก้าวหน้าอย่างรวดเร็ว: การศึกษาเชิงลึก 1 ปี European Spine Journal 21, 1135–1142, doi: 10.1007/s00586-012-2147-9 (2012)
Hu, ZJ, Zhao, FD, Fang, XQ และ Fan, SW การเปลี่ยนแปลงของ Modic: สาเหตุที่เป็นไปได้และการมีส่วนร่วมต่อการเสื่อมของหมอนรองกระดูกสันหลังส่วนเอว Medical Hypotheses 73, 930–932, doi: 10.1016/j.mehy.2009.06.038 (2009)
Krok, HV การแตกของหมอนรองกระดูกภายใน ปัญหาหมอนรองกระดูกเคลื่อนในผู้หญิงอายุมากกว่า 50 ปี Spine (Phila Pa 1976) 11, 650–653 (1986)
วันที่โพสต์: 13 ธันวาคม 2024